發育毒性及其評價

發育毒性及其評價第一頁，共九十三頁，2022年，8月28日目的與要求：1.掌握基本概念2.掌握Wilson發育毒理學基本原理3.了解發育毒性的作用機制4.熟悉發育毒性的評價第二頁，共九十三頁，2022年，8月28日第一節概述第三頁，共九十三頁，2022年，8月28日生殖與發育生殖是對親代動物而言，從配子生成、受精到胎體分娩是一生殖過程。發育主要是對子代而言，從受精卵到性成熟的青春期甚至一直到衰老都屬于發育過程。第四頁，共九十三頁，2022年，8月28日發育毒理學的發展簡史畸胎學（古代）現代實驗畸胎學（19世紀）發育毒理學第五頁，共九十三頁，2022年，8月28日畸胎學（古代）畸胎學是發育毒理學的基礎。畸胎學作為一門描述性科學在文字之前就已經存在了，四大文明古國都有畸胎的記載。最早可以追溯到公元前6500年土耳其的聯體嬰兒石刻。5000年前埃及壁畫所描述的唇腭裂和軟骨發育不全等。當時人們相信出生異常的嬰兒是上天的懲罰、星象的反應和未來的預兆，有的則以為是人和動物之間雜交的結果。隨著16~17世紀生物科學的發展，才逐漸對畸胎有了科學的認識。WilliamHarvey于1651年提出了發育受阻學說，認為畸形起因于器官或結構的不完全發育。第六頁，共九十三頁，2022年，8月28日現代實驗畸胎學（19世紀）現代實驗畸胎學始于19世紀初，當時的胚胎學家使用各種物理因素（震動、倒置、針刺）和化學毒物處理雞蛋，產生了畸形小雞，有神經管缺陷、無腦、脊柱裂、獨眼、心臟缺陷、位置顛倒和聯體雙胞胎等。他們還注意到作用時間在決定畸形類型方面比損傷的性質更為重要。第七頁，共九十三頁，2022年，8月28日20世紀早期20世紀早期發現多種環境因素（溫度、微生物毒素、藥物）可以干擾鳥、爬蟲類、魚和兩棲類的發育。開始人們以為哺乳動物胚胎對致畸因子具有耐受性，要么直接致死，要么受母體的保護，對胚胎沒什么影響。1935年，Hale首次報道維生素A缺乏誘導母豬產下突眼和腭裂的畸形后代。此后又有一些研究發現母體營養缺乏和許多環境因素，如氮芥、錐藍、激素、抗代謝藥、烷化劑、缺氧和X射線等可以引起哺乳動物畸形。第八頁，共九十三頁，2022年，8月28日重大歷史事件1940年澳大利亞發生風疹大流行，次年出生嬰兒中先天性白內障、耳聾、智力發育不全和先天性心臟病的發生率顯著增高。1945年日本廣島、長崎受原子彈核輻射的胎兒出生后患小頭畸形和智力低下，嬰兒一年內死亡率高達25%。1950年日本水俁灣甲基汞中毒發生先天性水俁病。1960～1962年間沙利度胺作為抗妊娠反應藥物應用后，出現8000例海豹畸形兒，表現為四肢短缺陷、無眼、腭裂、骨骼發育不全、十二指腸和肛門閉鎖等。1968年日本多氯聯苯污染米糠油事件，孕婦出現死產、早產或產下“油癥兒”。第九頁，共九十三頁，2022年，8月28日重大歷史事件1969年發現，母親妊娠18周前服用己烯雌酚，可誘發女性后代青春期陰道和宮頸透明細胞癌；男性后代則發生附睪囊腫、睪丸囊性硬結、小陰莖畸形及精子異常等。1970年Jone等描述了胎兒酒精綜合征，包括面部畸形、宮內和產后生長遲緩、精神運動和智力發育障礙及其他畸形。孕期吸煙也可能引起不良妊娠結局，包括流產、圍生期死亡、嬰兒猝死綜合征的危險性增加，學習和行為及注意力障礙，低出生體重等。可卡因暴露可引起多種不良發育效應，如胎盤早期剝離、早產和流產、小腦畸形、異常前腦發育、低出生體重、新生兒異常睡眠綜合征、震顫、泌尿生殖道畸形等。酒精綜合征第十頁，共九十三頁，2022年，8月28日發育毒理學在經歷了一系列重大事件后，人們對先天出生缺陷與環境因子之間的關系才有了深刻的認識，與此同時，發育毒理學也得到迅速地發展。第十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日第十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日馬丁·施奈德斯是荷蘭第一個“反應停兒童”第十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日美國反應停受害女孩第十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日第十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日第十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日第十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日第十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日浙江某藥廠一女工產后100天的女孩她只有一個半手指（2003）第十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日是研究發育中的生物體從受精卵、妊娠以及出生后直到性成熟期間，由于暴露于外源性理化因素而產生的各種發育異常及其機制，為理化因素的危險度或安全性評價和預防措施提供依據的一門學科。發育毒理學developmentaltoxicology第二十頁，共九十三頁，2022年，8月28日發育毒性的危害現代研究發現，人類成功妊娠結局的比率很低，只有不到半數的受孕能產生完全正常的健康嬰兒。美國的統計資料表明，著床后丟失（流產和死胎）占31%，著床前丟失（早早孕丟失）的比例更高。嬰兒出生時有嚴重畸形的占2%～3%（到1歲時因診斷明確使該比率上升為6%～7%

），輕微畸形占14%，低出生體重占7%。1歲前嬰兒死亡率1.4%，神經功能異常占16%～17%。我國29個省市，1986～1987年1234284例圍生兒調查結果，先天畸形率1.3%。以此推算，我國每年有30萬～40萬嚴重先天畸形兒出生，其中很大比例在一年內死亡。第二十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日小結發育毒理學(developmentaltoxicology）是研究發育中的生物體從受精卵、妊娠以及出生后直到性成熟期間，由于暴露于外源性理化因素而產生的各種發育異常及其機制，為理化因素的危險度或安全性評價和預防措施提供依據的一門學科。名詞解釋：第二十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日第二節發育毒理學的基本原理第二十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、基本概念發育毒性developmentaltoxicity

指出生前后接觸有害因素，子代個體發育為成體之前誘發的任何有害影響。能造成發育毒性的物質稱為發育毒物。發育毒性的主要表現：1.發育生物體死亡2.生長改變3.結構異常4.功能缺陷第二十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日發育毒性的主要表現：1.發育生物體死亡：指受精卵未發育即死亡，或胚泡未著床即死亡，或著床后生長發育到一定階段死亡。早期死亡被吸收或自子宮排出（即自然流產），晚期死亡成為死胎。2.生長改變：一般指生長遲緩。當胎兒生長發育指標低于正常對照的均值2個標準差時，可認定為生長遲緩。3.結構異常：指胎兒形態結構異常，即畸形。4.功能缺陷：包括生理、生化、免疫、行為、智力等方面的異常。功能缺陷往往要在出生后經過相當時間才被發現，如聽力或視力障礙，生殖功能障礙等。另外，有時把子代對某些疾病的易感性增加也歸入發育毒性，如孕期接觸己烯雌酚，女性后代易患青春期陰道癌。近年來提出肥胖和糖尿病等成年疾病的胎源學說更增加了這方面的例子。第二十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日胚體毒性（embryotoxicity）是指外源性理化因子對孕體著床前后直到器官形成期結束時的有害影響。胎體毒性或胎兒毒性（fetotoxicity）是指對孕體器官形成期結束以后的有害影響。胚胎毒性（embryo-fetaltoxicity）在實驗動物發育毒性試驗中，往往籠統地將胚體毒性和胎兒毒性叫做胚體-胎體毒性或胚胎毒性。廣義地說胚胎毒性包括孕體結構和功能方面的各種損害，但一般情況下胚胎毒性是指孕體的死亡和生長發育遲緩，而不包括結構畸形。一、基本概念第二十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日畸形（malformation）是發育生物體解剖學上形態結構的缺陷。能引起畸形的環境因子叫致畸物或致畸原，致畸物引起畸形的過程和特性叫致畸作用和致畸性。變異（variation）指同一種屬的子代與親代之間或子代的個體之間，有時出現不完全相同的現象，一般是小的或次要的結構改變。一、基本概念第二十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、基本概念出生缺陷（birthdefect）是指嬰兒出生前即已形成的發育障礙，包括畸形和功能缺陷。不良妊娠結局（adversepregnancyoutcomes）指妊娠后不能產生外觀和功能正常的子代，包括所有的不良結果，如流產、死胎、死產、宮內生長遲緩、發育異常、新生兒和嬰幼兒期死亡等。第二十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（一）對致畸的易感性取決于孕體的基因型及其與有害環境因子相互作用的方式。（二）對致畸的易感性隨著對有害因素暴露的發育時期的不同而變化。（三）致畸物以特異的方式（作用機制）作用于發育的細胞和組織，啟動一系列的異常發育事件（細胞病理機制）。（四）有害影響能否接近發育中的組織取決于有害影響本身的性質。（五）異常發育的四種表型是：死亡、畸形、生長遲緩和功能缺陷。（六）隨著劑量的增加，異常發育表型的頻率和程度也隨之增加，從無毒作用到全部致死。第二十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（一）對致畸的易感性取決于孕體的基因型及其與有害環境因子相互作用的方式每種致畸物各有其易感物種和品系，易感性取決于機體的基因型。物種和品系的差異是因代謝變化、胎盤種類、胚體發育的速度和方式引起的。外源性化學物生物轉化成活性中間產物的速度和途徑與遺傳有關，而畸形僅發生在那些形成活化代謝物的物種中。例如反應停4000mg/(kg·d)對大鼠和小鼠無致畸作用，而對人0.5~1.0mg/kg就有極強的致畸作用，這是由于人、猴和兔能將其代謝產生活性中間產物，而其他物種不能產生活性代謝產物。一種化學物在不同物種中的致畸作用，可能是不一致的，所以在篩選致畸物時，強調采用包括非嚙齒類在內的兩種動物進行試驗，以減少因實驗動物不敏感而出現的假陰性。第三十頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（二）對致畸的易感性隨著對有害因素暴露的發育時期的不同而變化研究證明器官形成期是發生形態結構畸形的關鍵期，即致畸敏感期。在器官形成期的細胞分化階段，要發生多種復雜易變的生物學事件，各種組織開始快速的細胞分裂，同時胚體的代謝能力有限；此階段接觸發育毒物，最易發生結構畸形，而一旦胚體的基本結構業已形成，就很難再改變其結構。人的器官形成期發生于妊娠的第3~8周。反應停致畸事件就在懷孕后的20~35天內，在無一般毒性的“安全劑量”[1mg/(kg·d)]下發生的，有的母親甚至在這階段內只服過一次藥。第三十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（二）對致畸的易感性隨著對有害因素暴露的發育時期的不同而變化此外，大多數器官都具有其特殊的致畸敏感期，即“靶窗”。形態畸形和功能缺陷的敏感期也各不相同。因此，致畸實驗的染毒時間，必須安排在器官形成期，才有可能觀察到畸形。由于各物種妊娠期長短不同，敏感期的長短也不同，致畸試驗的染毒時間需隨動物種屬而異。第三十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（二）對致畸的易感性隨著對有害因素暴露的發育時期的不同而變化在細胞分化之前接觸發育毒物，則要么導致胚體死亡，要么從損傷中完全恢復。胎體發育期是功能成熟的階段，此期接觸發育毒物，其主要表現為生長遲緩、發育阻滯、生理功能紊亂和神經行為異常。然而，若毒作用導致局部供血中斷，也同樣可引起結構的退變即畸形。第三十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（二）對致畸的易感性隨著對有害因素暴露的發育時期的不同而變化第三十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（三）致畸物以特異的方式（作用機制）作用于發育的細胞和組織，啟動一系列的異常發育事件（細胞病理機制）脊椎動物的發育是一個循序漸進、受到精細調節的過程，從細胞水平的生長增殖到組織、器官系統水平的形態形成無不是有條不紊的依次完成。每個過程或水平的異常改變，均可永久性的改變發育過程。一般而言，發育毒物對發育中的胚體的最初效應往往是發生于分子水平，并構成該毒物影響發育的分子機制。其后的事件則包括細胞、組織及機體水平上的發育偏差，并構成發育異常的細胞病理機制。由于脊椎動物發育的復雜性，一種發育毒物可能通過多種機制在同一時間、對同一個生物體發揮作用，雖然有可能是某種機制發揮主要作用。同樣，發育毒物還可通過同種或不同的機制在不同的器官引發發育異常，導致多種畸形。第三十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（四）有害影響能否接近發育中的組織取決于有害影響本身的性質有害影響能否接近發育中的組織一方面與其能否經胎盤轉移有關，另一方面與孕體對毒物的暴露模式有關。過去，人們認為母胎血流之間的多層細胞和細胞間質對胚體具有保護作用，并稱之為胎盤屏障。目前的研究則表明，這種保護頂多是一般性的，而胎盤膜事實上是一種超濾器。此外，還有多種化學物可利用胎盤對氨基酸和葡萄糖的特殊轉運機制，經母體轉移進入孕體。影響外源性化學物穿過胎盤的因素繁多，包括分子大小、荷電量、脂溶性、離子化程度、形成復合體、胎盤代謝和濃度梯度等。因此，胎盤僅能降低水溶性分子、大分子或電負性大的分子的轉運；而X射線、超聲和射頻輻射等可不經胎盤，直接從體外作用于孕體。化學物的發育毒性不僅取決于胚體的總暴露量，更取決于暴露速率。因為暴露速率過低，對細胞不能造成顯著的影響，同時胚體也有足夠的時間去修復損傷。第三十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（五）異常發育的四種表型是：死亡、畸形、生長遲緩和功能缺陷孕體死亡是指受精卵未發育即死亡，或胚泡未著床即死亡，或著床后生長發育到一定階段死亡。早期死亡被吸收或自子宮排出（即自然流產），晚期死亡成為死胎。能引起胚體死亡和畸形的毒物多數能引起生長遲緩。一般認為胎體的生長發育指標比正常對照的均值低2個標準差時，可認定為生長遲緩。胎鼠胸骨和枕骨骨化遲緩及低出生體重等是生長遲緩的較敏感指標。生長遲緩造成的局部發育不全可視為畸形，如腦小畸形和眼小畸形等。功能缺陷則包括器官系統、生化、免疫等功能的變化。功能缺陷往往要在出生后經過相當時間才能診斷，如聽力或視力異常、行為發育遲緩等。結構異常是指胎體形態結構的異常，即畸形。胚體死亡、畸形及生長遲緩之間的關系相當復雜，并且可隨受試化學物的種類、染毒時間及劑量不同而發生改變。第三十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、Wilson發育毒理學基本原理（六）隨著劑量的增加，異常發育表型的頻率和程度也隨之增加，從無毒作用到全部致死較大劑量致全窩胚胎死亡，一般劑量下正常、畸形和生長遲緩共存。常見反應模式。ABC在遠低于胚胎致死劑量下即出現致畸，甚至全窩致畸，常伴有生長遲緩。強致畸劑，少見。低劑量引起生長遲緩，高劑量引起胚胎死亡。無畸形發生。發育毒性的劑量-反應模式致畸作用的劑量反應曲線較為陡峭第三十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日發育毒性的影響因素1.機體因素：遺傳因素：種屬差異和個體差異2.化學物因素（1）化學物的理化性質（2）化學物的作用時間（3）化學物的劑量自己總結第三十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的間接影響因素母體毒性胎盤毒性父源性發育毒性其他因素（一）（二）（三）（四）第四十頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的間接影響因素(一)母體毒性母體毒性是指受試物對妊娠母體的有害效應，母體毒性可能特異（直接）的或非特異（間接）的影響發育過程，導致發育毒性。影響發育毒性的母體因素包括：1.遺傳2.疾病3.營養4.應激第四十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的間接影響因素(一)母體毒性母體毒性與發育毒性之間的關系常見的有以下幾種：1.具有發育毒性，但無母體毒性，表示發育毒性有特定的機制，與母體毒性無關。如沙利度胺。這類化學物最容易被忽視也最危險。2.出現發育毒性也出現母體毒性，尤其是當發育毒性只在母體毒性存在時才能被觀察到的時候，發育效應可能是間接的，往往不具有特定的致畸機制。許多已知的人類發育毒物，包括乙醇和可卡因，主要在母體毒性水平對胚胎/胎兒有有害影響，它們的發育毒性可能部分歸因于母體生理學紊亂的繼發效應。如嗜酒者通常營養狀態不良，而且酒精影響營養物的胎盤轉運，可增強對孕體的直接效應。3.具有母體毒性，但不具有致畸作用。這類物質在妊娠期容易引起警覺，避而遠之。4.在一定劑量下，既無母體毒性，也不表現發育毒性。第四十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的間接影響因素(二)胎盤毒性某些化學物可對胎盤造成損傷，改變胎盤血流量，降低胎盤對營養物質的轉運，特異地干擾胎盤的內分泌和代謝功能，間接地引起發育毒性。5-羥色胺引起的小鼠動、靜脈狹窄，胎盤血流量減少，胎盤轉運功能障礙，死胎和先天畸形。甲基汞可改變人胎盤滋養層微絨毛對氨基酸的攝取，導致功能障礙（即先天性水俁病），患兒出現嚴重的神經遲鈍、共濟失調、步行困難、語言和下咽障礙以及癲癇大發作。第四十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的間接影響因素(三)父源性發育毒性越來越多的人群流行病學研究發現某些出生缺陷也與男性因素有關，被稱為父源性出生缺陷。引起父源性出生缺陷的因素主要有：遺傳缺陷年齡因素外界暴露因素第四十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的間接影響因素(三)父源性發育毒性有出生缺陷的男性，其后代出現出生缺陷的幾率是正常人群的2倍，甚至高于母親有出生缺陷的后代，其中患與父親相同缺陷的危險性是正常人群的7倍。20~24歲的父親所生的后代，與25~29歲的父親所生的后代相比更容易得腹裂畸形，40歲以上父親所生的后代患13號染色體三體綜合征較少，但患乳腺癌的幾率增加。外界暴露因素包括職業和環境暴露、化療和放療、其他藥物以及飲酒、抽煙等不良嗜好。這些因子通過父親對發育個體產生不良影響，因此叫作父源性發育毒性。父源性暴露可以引起的子代發育異常包括流產、死胎、低出生體重、畸形、功能障礙等，甚至可能與兒童腫瘤相關。第四十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的間接影響因素(四)其他因素染毒途徑可影響致畸試驗的結果，大鼠受孕等7~14天經口給予EDTA，引起70%的胎鼠畸形，但以同樣劑量皮下注射，對母體毒性增加，卻未見明顯的胎鼠畸形。反應停對大鼠灌胃不引起胎鼠畸形，而經飼料染毒幾乎全部肧體致死。第四十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日小結發育毒性（developmentaltoxicity）指出生前后接觸有害因素，子代個體發育為成體之前誘發的任何有害影響。畸形（malformation）是發育生物體解剖學上形態結構的缺陷。名詞解釋：第四十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日小結Wilson發育毒理學基本原理（一）對致畸的易感性取決于孕體的基因型及其與有害環境因子相互作用的方式。（二）對致畸的易感性隨著對有害因素暴露的發育時期的不同而變化。（三）致畸物以特異的方式（作用機制）作用于發育的細胞和組織，啟動一系列的異常發育事件（細胞病理機制）。（四）有害影響能否接近發育中的組織取決于有害影響本身的性質。（五）異常發育的四種表型是：死亡、畸形、生長遲緩和功能缺陷。（六）隨著劑量的增加，異常發育表型的頻率和程度也隨之增加，從無毒作用到全部致死。第四十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日第三節發育毒性的作用機制第四十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（一）干擾有絲分裂（二）能量供應的改變（三）代謝酶的抑制（四）氧化應激反應（五）干擾核酸代謝（六）基因表達改變（七）基因突變與染色體畸變（八）細胞凋亡第五十頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（一）干擾有絲分裂肧體發育過程中，細胞增殖率高，但協調有序。因此，干擾有絲分裂，即改變細胞增殖速率是化學物誘發發育異常的一種常見方式。同一組織器官中的各類細胞的分裂速率不同，導致某些細胞對化學物暴露尤為敏感。一般而言，延遲或阻斷細胞周期的各種理化因素均可干擾有絲分裂，而暴露毒物后引起的代償性分裂速率增加也同樣與致畸作用有關。影響細胞分裂的途徑包括：1.DNA合成的降低；2.干擾細胞質的形成或分離；3.影響紡錘體的形成和維持。抗腫瘤藥5-氟尿嘧啶抑制S期DNA合成，誘發結構畸形。第五十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（二）能量供應的改變肧體發育過程中，生物合成、增殖活動旺盛，有氧代謝和氧化磷酸化也在妊娠過程中不斷增加，因此，改變肧體的能量供應可引起發育異常。鎮靜和催眠藥物苯巴比妥通過抑制線粒體呼吸，可引起骨骼畸形、枕骨及胸骨骨化延遲。第五十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（三）代謝酶的抑制某些酶因為參與體內的合成或氧化代謝，尤其是DNA和RNA的合成，可影響細胞的生長與增殖，抑制其活性對肧體發育過程有較大的影響。抗腫瘤藥甲氨蝶呤為二氫葉酸還原酶的競爭性抑制劑，宮內接觸甲氨蝶呤可引起顱面部畸形、肢體變形和胎體生長遲緩。第五十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（四）氧化應激反應用來治療癲癇發作及洋地黃引起的心律過快的苯妥英經生物活化在親體和肧體的組織引起脂質過氧化，蛋白質氧化和蛋白質降解，這些生物化學的變化可能是化學致畸的主要原因。第五十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（五）干擾核酸代謝DNA與RNA的合成及正常功能的發揮對肧體細胞的增殖異常重要，因此干擾核酸的代謝可引起發育毒性。抗腫瘤藥羥基脲可抑制核糖核苷酸還原酶，從而抑制DNA的復制，并誘發大鼠肢體、腭、下頜及尾的畸形和肧體死亡。第五十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（六）基因表達改變發育過程中的基因表達具有特異性、協同性；因此，改變基因和蛋白質的表達可導致嚴重的發育后果。除基因序列改變以外，非基因序列所致基因表達水平和基因功能的改變，即表觀遺傳學改變，也影響胚胎的發育。第五十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（六）基因表達改變有報道在培養的小鼠胚胎中用反義寡核苷酸探針抑制原癌基因Wnt-1或Wnt-3a的表達，都可產生中腦和后腦，或中腦、后腦和脊髓的畸形。孕鼠飼料中添加染料木黃酮等誘發DNA甲基化的化合物，可以改變子代皮毛的顏色。第五十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（七）基因突變與染色體畸變胚胎發育過程中基因起控制作用，而化學物可使基因正常的控制過程發生轉向，嚴重時胚胎發育可完全停止而死亡。已知的誘變劑往往有潛在致畸性，如電離輻射、烷化劑、亞硝酸鹽等；多數致癌物引起基因突變和染色體畸變，也有致畸作用。有報道染色體畸變占人類發育缺陷原因的3%左右。第五十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（八）細胞凋亡細胞凋亡又叫程序性細胞死亡（PCD），指肧體在遺傳基因的控制下的特定類型的細胞死亡。PCD在肧體發育過程中可發揮多種作用，如為肧體提供合適的形態、除去殘留的結構等。中樞神經系統的細胞在發育過程中，約有半數需通過PCD清除，以構建神經連接網絡。由于PCD對正常的形態發生必不可少，因此，改變PCD的發生模式是致畸過程的一種重要機制；機體的畸形高發區，也常常是PCD的發生區域。第五十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、異常發育的分子機制（八）細胞凋亡二惡英可通過改變PCD的正常模式，而誘發畸形。小鼠肧體上顎架的中央上皮細胞通常于妊娠第14~16天停止分裂，對表皮生長因子的反應性也隨之降低；之后，中央上皮細胞與基底細胞脫離，絕大部分細胞通過細胞凋亡途徑死亡。相反，在妊娠第10天接觸二惡英的上顎架持續表達表皮生長因子受體，不發生上皮細胞的凋亡。第六十頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、異常發育的細胞學機制（一）細胞死亡（二）細胞增殖（三）細胞信號通路的改變（四）影響細胞遷徙與分化第六十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、異常發育的細胞學機制（一）細胞死亡早期肧體細胞保留較大的分化多能性，因此，發生細胞死亡后所存留的細胞可恢復因細胞死亡帶來的細胞丟失，并對后期發育影響甚少。然而，當細胞死亡數量超出肧體的恢復能力時，則導致肧體死亡或畸形。細胞死亡的病理學后果，既取決于受損細胞的特性和所處的位置，又取決于細胞死亡的程度與范圍。有很多化學物通過誘發受損的組織、器官的細胞死亡率增加，而引起發育異常。第六十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、異常發育的細胞學機制（一）細胞死亡不同的組織對細胞死亡的敏感性也各不相同，如前腦神經上皮細胞對高熱引起的細胞死亡異常敏感，而心臟和卵黃囊則對細胞死亡具有耐受性。免疫抑制劑環磷酰胺等化學物定向作用于增殖的細胞，首先導致細胞周期的改變，進而引起細胞凋亡。反之，維甲酸等發育毒物通過增加某些組織區已有的細胞程序性死亡，而引起發育異常。研究表明，接觸維甲酸引起正常細胞死亡區域的死亡率增加，過多的細胞死亡則導致脊柱裂、指（趾）缺陷、顱面畸形。第六十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、異常發育的細胞學機制（二）細胞增殖同細胞死亡一樣，細胞增殖速率下降可減少組織細胞的數量，并影響后期的生長與分化。細胞增殖率下降既可能源于細胞周期進程的趨緩，也可能源于生長因子的缺乏、誘導因子的不足和細胞對外部因子反應性的降低。研究表明，抗癲癇藥物丙戊酸、免疫抑制劑環磷酰胺等可通過干擾DNA合成而改變細胞周期的進程。小鼠體內研究發現，丙戊酸引起的細胞周期阻滯可能涉及神經上皮核糖核苷酸還原酶的改變，并與丙戊酸引起的神經管缺陷有關。第六十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、異常發育的細胞學機制（三）細胞信號通路的改變細胞信號通路是肧體模式形成及分化的基礎，也是決定發育毒物細胞病理機制的重要環節。信號通路通過分泌時空特異性分布的細胞產物來控制形態發生過程。其下游生物學事件通常為轉錄水平的改變，并導致靶細胞基因表達的變化。無論是改變信號分子的分泌，還是改變信號分子的轉導，均可引起形態發生過程的實質性改變。信號轉導的改變通常包括受體、轉錄因子、下游信號分子等的表達和間隙連接的分布這兩個方面。第六十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、異常發育的細胞學機制（三）細胞信號通路的改變發育毒物可通過誘發分化誘導子的缺乏，通過誘發影響到細胞分化、細胞增殖、死亡的靶細胞的缺失，通過信號分子生物合成的障礙，或通過干擾信號向靶細胞的傳遞，而改變形態發生過程中的細胞信號通路。實際上，多種環境化學物導致的出生缺陷的細胞病理機制都牽涉到細胞信號通路的改變。細胞毒藥物可改變多條信號通路，而某些受體介導的致畸原，如維甲酸，則僅改變特定的信號通路。維甲酸可改變小鼠肧體的AER-EGF-4-ZPA信號通路，進而誘發肢體缺陷。第六十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、異常發育的細胞學機制（四）影響細胞遷徙與分化在肧體發育早期，神經冠從神經褶背側的神經上皮發育而來。在囊胚分層及上皮-間質轉化的過程中，神經冠細胞脫離神經上皮，并開始遷徙；其后經過廣泛的遷徙，神經冠細胞逐步分化為面部結締組織、外周神經組織成分及黑素細胞等。由于神經冠細胞的遷徙分化對多種組織器官的發育必不可少，若發育毒物干擾這一遷徙分化過程（如抑制細胞骨架的形成），勢必會造成肧體發育的廣泛性受損。例如，維甲酸通常要參與后腦神經冠細胞命運的確定過程，然而，在較高的濃度下，維甲酸可改變神經冠細胞的特性，導致遷徙模式的變化和靶組織的結構畸形。第六十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日維甲酸維A酸是體內維生素A的代謝中間產物。適應癥：尋常痤瘡、特別是黑頭粉刺皮損，老年性、日光性或藥物性皮膚萎縮，魚鱗病及各種角化異常及色素過度沉著性皮膚病、銀屑病。第六十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日第四節發育毒性的評價第六十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日發育毒性的評價流行病學調查動物發育毒性試驗發育毒性的預篩試驗第七十頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、發育毒性的流行病學調查流行病學研究的目的：尋找出生缺陷的原因有助于了解出生缺陷的發展趨勢引起公眾對出生缺陷的注意第七十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、動物發育毒性試驗主要試驗方案：1.三段生殖毒性試驗主要用于評價藥物的生殖發育毒性。1966年美國食品與藥品管理局（FDA）首先提出，后經多次改進，我國食品藥品監督管理局（SFDA）規定的新藥生殖發育毒性試驗也參照此方案。2.一代和多代生殖毒性試驗主要用于評價食品添加劑、農藥及其他化學物的生殖發育毒性。由美國環境保護局（EPA）首先提出。3.改進的大鼠發育神經毒性的試驗程序。1988年EPA發布。第七十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日連續、完整的生殖發育過程的六個階段A.從交配前到受孕：檢查成年雄性和雌性生殖功能、配子的發育與成熟、交配行為、受精。B.從受孕到著床：檢查成年雌性生殖功能、胚胎著床前發育、著床。C.從著床到硬腭閉合：檢查成年雌性生殖功能、肧體發育、主要器官形成。D.從硬腭閉合到妊娠結束：檢查成年雌性生殖功能、胎體的發育與生長、器官的發育與生長。E.從出生到斷乳：檢查成年雌性生殖功能、新生仔對宮外生活的適應性、斷乳前的發育與生長。F.從斷乳到性成熟：檢查斷乳后的發育與生長、對獨立生活的適應、達到完全的性功能。第七十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日三段生殖毒性試驗主要是根據以上發育階段的區別來設計的，每一段試驗大致相當于上述兩個階段。Ⅰ段：生育力和早期胚胎發育毒性試驗（一般生殖毒性試驗）Ⅱ段：肧體-胎體毒性試驗（致畸試驗）Ⅲ段：出生前后發育毒性試驗（圍生期毒性試驗）三段生殖毒性試驗分別為第七十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日2周第七十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日Ⅰ段：生育力和早期胚胎發育毒性試驗（一般生殖毒性試驗）目的：評價受試物對配子成熟、交配行為、生育力、胚胎著床的影響（前述生殖周期的A和B階段）。給藥期：雄性從交配前4周開始染毒，并持續至交配成功；雌性交配前2周開始染毒（以覆蓋3~4個動情周期），至妊娠第6天受精卵著床。第七十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日Ⅱ段：肧體-胎體毒性試驗（致畸試驗）目的：評價自胚泡著床到硬腭閉合階段暴露受試物對妊娠母體和胚胎與胎仔發育的有害效應。包括母體毒性、胚胎或胎兒死亡、生長改變和結構異常。給藥期：為著床期到硬腭閉合，即器官形成期；大、小鼠為受孕第6~15天，家兔為第6~18天。第七十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日Ⅲ段：出生前后發育毒性試驗（圍生期毒性試驗）目的：評價母體從著床至斷乳期間接觸受試物對妊娠/哺乳母體和對胎仔及仔代直至性成熟的有害效應。給藥期：著床期開始，至仔鼠斷乳。大鼠孕15天至產后28天。第七十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的預篩試驗（一）體外預篩試驗（二）發育毒性的體內預篩試驗（C.K試驗）第七十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的預篩試驗（一）體外預篩試驗體外發育毒性試驗方法操作簡單，可嚴格控制試驗條件，試驗結果與整體動物致畸試驗有較好的相關性（有母體毒性者除外）。因此可利用體外試驗方法作發育毒物的初篩，預測對整體動物的發育毒性，發現毒作用的靶器官，或闡明發育毒性的作用方式和機制。體外試驗系統使得快速篩選發育毒物成為可能，但體外模型缺乏發育過程的復雜性，試驗結果外推到人類的發育毒性風險比整體動物試驗大。此外，體外系統大多有待標準化和認證研究。第八十頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的預篩試驗（一）體外預篩試驗1.大鼠全胚胎培養2.胚胎細胞微團培養3.小鼠胚胎干細胞試驗第八十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的預篩試驗（一）體外預篩試驗1.大鼠全胚胎培養將嚙齒動物胚胎移植到體外培養，其生長與分化與在母體子宮內發育的胚胎相似。第八十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、發育毒性的預篩試驗（一）體外預篩試驗2.胚胎細胞微團培養是孕期第11天的大鼠胚胎取得代表中樞神經系統的原代中腦細胞微團、肢芽區或其他區的細胞微團，在培養瓶中分別加入不同濃度的受試物共同培養5天。可以用中性紅染色判斷細胞存活；用Alcian藍染色判斷肢芽軟骨細胞分化數量；蘇木素染色判斷中樞神經系統細胞分化數量。對結果進行處理，求出影響