實驗五蛋白質的顏色反應和沉淀反應

實驗五蛋白質的顏色反應和沉淀反應第一頁，共十五頁，2022年，8月28日蛋白質顏色反應原理

蛋白質分子中的某種或某些基團與顯色劑作用，可產生特定的顏色反應。不同蛋白質所含氨基酸不完全相同，顏色反應亦可不同。顏色反應不是蛋白質的專一反應，一些非蛋白物質亦可產生相同的顏色反應，因此不能僅根據顏色反應的結果決定被測物是否是蛋白質。顏色反應是一些常用的蛋白質定量測定的依據。第二頁，共十五頁，2022年，8月28日常見的蛋白質顏色反應

米倫氏反應

雙縮脲反應

黃色反應

茚三酮反應

乙醛酸反應

第三頁，共十五頁，2022年，8月28日（一）米倫氏（Millon）反應

原理：米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞和亞硝酸汞之混合物，能與苯酚、雙酚及某些羥苯衍生物產生顏色反應。這些反應最初產生的有色物質可能為羥苯之亞硝基衍生物，經變位作用變成顏色更深的鄰醌肟，最終形成紅色穩定產物。組成蛋白質的氨基酸中只有酪氨酸為羥苯衍生物，因此該反應為酪氨酸的顯色反應（酚羥基反應）。

注意事項：加熱時容易產生暴沸，要注意安全，應溫和加熱。第四頁，共十五頁，2022年，8月28日（二）雙縮脲反應

原理：將尿素加熱，兩分子尿素放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環境中，能與硫酸銅結合成紅紫色的絡合物，此反應為雙縮脲反應。蛋白質分子中含有肽鍵與縮脲結構相似，故能呈此反應。一般肽鍵越多顏色越深，而且受蛋白質特異性影響小注意事項：硫酸銅不能多加，否則會產生影響觀察的藍色絡離子Cu(NH3)42+第五頁，共十五頁，2022年，8月28日（三）黃色反應

原理：蛋白質分子中含有苯核結構的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），遇到硝酸可硝化成黃色物質，此物質在堿性環境中變為橘黃色的硝苯衍生物。這是含酪氨酸和色氨酸蛋白質所特有的反應。皮膚、指甲和毛發等遇濃硝酸變黃，原因在此。（四）茚三酮反應

原理：蛋白質與茚三酮共熱，則產生藍色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應為一切蛋白質及－氨基酸所共有。注意事項：反應必須在pH5-7進行。第六頁，共十五頁，2022年，8月28日（五）乙醛酸反應

含色氨酸的蛋白質在濃硫酸中與一些醛類反應能形成有色物質。此反應可作為色氨酸的定性定量反應。１、在蛋白質溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環形成２、色氨酸的反應（吲哚環的反應）３、鑒定蛋白質中是否含有色氨酸實驗步驟第七頁，共十五頁，2022年，8月28日蛋白質沉淀反應原理

在水溶液中蛋白質分子的表面由于形成水化層和雙電層，而成為穩定的膠體顆粒。但這種穩定性是有條件的、相對的。在一定的物理化學因素影響下，蛋白質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性而喪失穩定因素，即以固態形式從溶液中析出，這種作用稱為蛋白質的沉淀反應。

可逆沉淀反應：在發生沉淀反應時，蛋白質雖已沉淀析出，蛋白質分子內部結構并未發生顯著變化，基本上保持原有的性質。除去沉淀因素后，蛋白質沉淀可再溶于原來的溶劑中。

不可逆沉淀反應：在發生沉淀反應時，蛋白質分子內部結構，特別是天然結構遭到破壞，失去其天然蛋白質的原來性質，這種蛋白質沉淀不能再溶解于原來的溶劑中。第八頁，共十五頁，2022年，8月28日常見的蛋白質沉淀反應

蛋白質鹽析作用酒精沉淀蛋白質重金屬鹽沉淀蛋白質生物堿試劑沉淀蛋白質有機酸沉淀蛋白質無機酸沉淀蛋白質加熱沉淀蛋白質第九頁，共十五頁，2022年，8月28日（一）蛋白質鹽析作用原理：向蛋白質溶液中加入中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等）至一定濃度，使蛋白質脫去水化層而聚集沉淀。沉淀不同的蛋白質所需中性鹽的濃度也不同。

注意事項：１、應先加蛋白質溶液，然后加飽和硫酸銨溶液；２、固體硫酸銨若加到過飽和則有結晶析出，勿與蛋白質沉淀混淆。（二）酒精沉淀蛋白質原理：酒精為脫水劑，能破壞蛋白質膠體質點的水化層而使其沉淀析出。第十頁，共十五頁，2022年，8月28日（三）重金屬鹽沉淀蛋白質原理：當溶液PH大于等電點時，蛋白質顆粒帶負電荷，這樣它就容易與重金屬鹽（如Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+等）結合形成不溶性鹽類而沉淀。注意事項：使用乙酸鉛或硫酸銅沉淀蛋白質時，試劑不可加過量，否則可使沉淀出的蛋白質重新溶解。為什么？（四）生物堿試劑沉淀蛋白質原理：植物體內具有顯著生理作用的含氮堿性化合物稱為生物堿。能沉淀生物堿或與其產生顏色反應的物質稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。當溶液PH小于等電點時，蛋白質顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑發生反應生成不溶性鹽而沉淀。第十一頁，共十五頁，2022年，8月28日（五）有機酸沉淀蛋白質原理：當溶液PH小于等電點時，蛋白質顆粒帶正電荷，容易與某些有機酸如三氯乙酸和磺基水楊酸等的酸根負離子發生反應生成不溶性鹽而沉淀。這個反應可將生物體液中的蛋白質完全清除。（六）無機酸沉淀蛋白質原理：濃無機酸（磷酸除外），能使蛋白質發生不可逆的沉淀反應。這種沉淀作用可能是蛋白質顆粒脫水的結果。第十二頁，共十五頁，2022年，8月28日（七）加熱沉淀蛋白質原理：幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝固，變成不可逆的不溶狀態。鹽類和氫離子濃度對蛋白質加熱凝固有重要影響。少量鹽類促進蛋白質的加熱凝固。當蛋白質處于等電點時，加熱凝固最完全、最迅速。在酸性或堿性溶液中，蛋白質分子帶有正電荷或負電荷，雖加熱蛋白質也不凝固。若同時有足量的中性鹽存在，則蛋白質可因加熱而凝固。加熱變性引起蛋白質凝固沉淀的原理可能是由于熱變性使蛋白質天然結構解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時由于蛋白質處于等電點也破壞了帶電狀態。第十三頁，共十五頁，2022年，8月28日實驗注意事項

實驗中使用的試劑種類繁多，注意防止所使用試劑的交叉污染。注意滴管的正確使用，防止酸、堿或有機試劑污染滴頭。在實驗中，特別是酒精燈加熱過程中要注意操作規范，注意實驗安全.雙縮脲反應時試管