基因工程基本操作過程

1.2基因工程的基本操作程序復習提問：1、基因工程需要的三種工具是什么？2、限制酶的作用是什么？產生的DNA片段末端通常有哪兩種形式？3、DNA連接酶有哪兩種？它們的作用是什么？4、能“縫合”平末端的是哪種酶？5、基因工程中最常用的運載體是什么？補:基因結構相關知識點原核生物基因結構真核生物基因結構原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子

RNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質編碼區非編碼區原核細胞的基因結構②有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點。即:啟動子真核細胞的基因結構編碼區非編碼區非編碼區與RNA聚合酶結合位點內含子

外顯子

能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子

不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子啟動子終止子編碼區上游編碼區下游內含子：外顯子：真核細胞的基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區上游的RNA

聚合酶結合位點。非編碼序列：包括非編碼區和內含子原核細胞真核細胞不同點編碼區是_____的編碼區是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______和具有調控作用的______區組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續不連續編碼區非編碼基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞操作過程目的基因的檢測與鑒定目的基因主要是指______________________編碼蛋白質的結構基因目的基因的獲取供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：將需要的基因從供體生物細胞內提取出來目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。獲得目的基因的方法

1）從基因文庫中獲取目的基因1.什么是基因文庫？2.怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？2）2）利用PCR技術擴增目的基因3）人工合成

種類：基因組文庫：如:cDNA文庫：含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據基因的有關信息：如基因的轉錄產物mRNA部分基因文庫：概念?如何構建基因文庫?1.用一定的_________切割質粒，使其出現一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產生_________________?！诵?.將切下的目的基因片段插入質粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達載體的構建基因表達載體的構建——核心質粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種限制酶目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。科學家在培育抗蟲棉時，經過了許多復雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:基因表達載體的組成：目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因(三)將目的基因導入受體細胞常用的受體細胞：動植物細胞、大腸桿菌、土壤農桿菌、枯草桿菌等。將目的基因導入受體細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。轉化——目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩定表達方法導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態細胞吸收DNA分子(三)將目的基因導入受體細胞(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定—①檢測轉基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交即個體生物學水平的鑒定PCR技術—聚合酶鏈式反應

原理：前提：條件：PCR擴增儀DNA雙鏈復制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的兩條鏈為模板溫度控制類別項目

復制

轉錄場所特點模板原料酶能量堿基配對產物細胞核只有DNA的一條鏈四種核糖核苷酸RNA聚合酶ATPA-UC-GT-AG-C細胞核DNA的兩條鏈四種脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶ATPA-TC-GT-AG-C兩個雙鏈DNA分子一條單鏈mRNA邊解旋邊復制，半保留復制邊解旋邊轉錄5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G變性復性延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；2.引物與單鏈互補結合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ利用PCR技術擴增目的基因PCR技術擴增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復性（55℃-60℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成1）反轉錄法：

以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成2）根據已知的氨基酸序列合成DNA法：1.微生物作受體細胞原因：將目的基因導入微生物細胞3.轉化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少

處理細胞→

細胞→表達載體與感受態細胞混合→_________細胞吸收DNA分子。Ca2+感受態感受態2.常用菌：其做為受體有何優點?目的基因插入Ti質粒的T-DNA上農桿菌導入植物細胞整合到受體細胞的染色體上

目的基因的遺傳特性得以維持穩定和表達

1.農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質粒的T-DNA可轉移至受體細胞的染色體上2.轉化如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經轉錄。1.下表關于基因工程中有關基因操作的名詞及對應的內容，正確的組合是 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細胞中提?、芾肞CR技術⑤利用DNA轉錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥3.細菌的質粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是

A．提高受體細胞在自然環境中的耐藥性B．有利于對目的基因是否導入進行檢測C．增加質粒分子的分子量D．便于與外源基因連接4.

有關基因工程的敘述正確的是A．限制酶只在獲得目的基因時才用B．重組質粒的形成是在細胞內完成的C．質粒都可作為運載體D．蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料5.哪項不是基因表達載體的組成部分()A.啟動子B.終止密碼

C.標記基因D.目的基因6.下列哪項不是將目的基因導入植物細胞的方法()A．基因槍法B．顯微注射法

C.農桿菌轉化法D．花粉管通道法胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產量之低和價格之高可想而知。假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生產出人的胰島素，想一想，如何設計？嘗試設計一、目的基因的獲取（一）基因文庫（二）構建基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。2.基因文庫的構建方法①：直接分離法供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶受體細胞產生特定性狀導入外源DNA擴增目的基因分離(鳥槍法)一、目的基因的獲取（一）從基因文庫中直接獲取多用于原核生物逆轉錄法目的基因的信使RNA目的基因化學合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成逆轉錄2.基因文庫的構建方法一、目的基因的獲取（一）從基因文庫中直接獲取