基因工程的載體和受體

基因工程的載體和受體5學時）1第1頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四

一、用于基因克隆的載體5學時）（1）攜帶外源DNA進入宿主細胞的工具。（2）能夠運載外源DNA片段（目的基因）進入受體細胞，具有自我復制能力，使外源DNA片段在受體細胞中得到擴增和表達，不被受體細胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子。（3）實質：用來攜帶目的基因片段進入受體細胞。1.載體的概念2第2頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四5學時）32.載體的功能（functionofvector）運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件第3頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四3.載體應具備的條件（characteristicsofvector）可轉移性：具有針對受體細胞的親緣性或親和性。具有與受體細胞相適應的復制位點（ori，originofreplication）或整合位點。具有較高的外源DNA的裝載能力。多克隆位點（multiplecloningsite,MCS）：具有多種限制性內切酶的單一切點

。具有合適的篩選標記（selectionmarker）。安全，不含對受體細胞有害的基因，不會任意轉入受體細胞以外的其他生物細胞中。5學時）4第4頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四質粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體5學時）4.載體的種類5第5頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（一）質粒（plasmid）1.質粒的定義質粒是生物細胞內固有的、能獨立于染色體而自主復制，并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。質粒常見于原核細菌和真菌中。絕大多數(shù)的質粒是DNA型的。絕大多數(shù)質粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，即cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）。質粒DNA的分子量范圍：1-300kb。功能：進行細胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。5學時）6第6頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（1）質粒的自主復制性質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制。根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質粒可分為兩大復制類型：嚴緊型復制控制的質粒：1-3拷貝stringentplasmid松弛型復制控制的質粒：10-60拷貝relaxedplasmid但這種對應關系不是絕對的，若細胞生長環(huán)境中存在蛋白質合成抑制劑（氯霉素、壯觀霉素等）時，細胞的染色體DNA的復制受阻，而質粒仍可擴增，使其數(shù)量可達數(shù)千拷貝。2.質粒的基本特征5學時）7第7頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（2）質粒的不相容性（incompatibility）任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質粒的不相容性，不相容性的質粒組成不相容性群。以大腸桿菌的質粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復制子結構，彼此不相容；pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結構，彼此不相容；p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容。5學時）8通常一個質粒含有一個與相應的順式作用控制要素結合在一起的復制起始區(qū)（整個遺傳單位定義為復制子）。在不同的質粒中，復制起始區(qū)的組成方式是不同的，有的可決定復制的方式，如滾環(huán)復制和θ復制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個來源于pMB1質粒或ColE1質粒的復制起始位點。第8頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四質粒不相容的分子機制兩種含有相似復制子結構的質粒，在復制時受同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的控制而產(chǎn)生競爭，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)不同。其中，拷貝數(shù)多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢，并逐步將另一質粒“稀釋”淘汰。兩種含有不同復制子結構的質粒，在復制時受各自的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調節(jié)，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此經(jīng)過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內。5學時）9第9頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（3）質粒的可轉移性據(jù)此，革蘭氏陰性菌的質粒可分成兩大類：接合型質粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F質粒。非接合型質粒：不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用如Col、R質粒的一些成員。值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉移，這個過程由bom和mob基因決定。5學時）10第10頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（4）攜帶特殊的遺傳標記野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質合成：細菌毒素、有機堿這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義。5學時）11第11頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四3.幾種代表性質粒F–因子（fertilityfactor）：又稱致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相當于核染色體DNA大小的2%，環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關。存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中，決定性別。5學時）Figure.RepresentativeFERTILITYPLASMID.Afertilityplasmidcarriesthegenesforconjugationaswellasanumberofothergenes.Inthisfigurethefertilityplasmidalsocarriesantibioticresistantgenes.12第12頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（Shigelladysenteriae），后來發(fā)現(xiàn)還存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相連的兩個DNA片段組成，即抗性轉移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性決定R因子（r-determinant）。RTF為分子量約為11×106Dalton，控制質粒拷貝數(shù)及復制。抗性決定因子大小不固定，從幾百萬到100×106Dalton以上，其上帶有抗生素的抗性基因。R因子在細胞內的拷貝數(shù)：從1~2個到幾十個，分為嚴緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質粒可達2000~3000個/細胞。5學時）R因子（resistancefactor）13第13頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四Col因子（colicinogenicfactor）含有編碼大腸桿菌素因子的質粒。大腸桿菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的細菌素，能通過抑制復制、轉錄、翻譯或能量代謝等專一地殺死其它腸道細菌，由Col因子編碼。Col因子可分為兩類，分別以ColE1和ColIb為代表。ColE1：分子量約為5×106Dalton，無接合作用，多拷貝；ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組DNA的研究和用于體外復制系統(tǒng)上。ColIb分子量約為80×106Dalton，與F因子相似，具有通過接合作用轉移的功能，屬于嚴緊型控制，只有1~2個拷貝。凡帶Col因子的菌株，由于質粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。5學時）14第14頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質粒可以編碼一系列能降解復雜物質的酶，從而能利用一般細菌所難以分解的物質作碳源。這些質粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟腦）質粒，XYL（二甲苯）質粒，SAL（水楊酸）質粒，MDL（扁桃酸）質粒，NAP（萘）質粒和TOL（甲苯）質粒等。5學時）降解性質粒近年來在Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質粒，分子量為200~300×106Dalton，比一般質粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質粒，其上有一系列固氮基因。巨大質粒（mega質粒）15第15頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四Ti質粒（tumorinducingplasmid）誘癌質粒存在于根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）中,可引起許多雙子葉植物的根癌。當細菌侵入植物組織后，可以把細菌的DNA釋放到植物細胞中。這時，Ti質粒的小片段與植物細胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞控制細胞分裂的激素調節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉變成癌細胞。Ti質粒大小約200kb，是一個大型質粒。當前，Ti質粒已成為植物遺傳工程研究中的重要載體。一些具有重要性狀的外源基因可借DNA重組技術設法插入到Ti質粒中，并進一步使之整合到植物染色體上，以改變該植物的遺傳性，達到培育植物優(yōu)良品種的目的。5學時）16第16頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四4.質粒的改造天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工改造。5學時）17第17頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四刪除不必要的DNA區(qū)域，縮小分子量，提高外源DNA片段的裝載量滅活質粒上的某些編碼基因加入易于識別的選擇標記基因選擇標記基因內引入內切酶的酶切位點序列---多克隆接頭(Polylinker)加入特殊的基因表達調控元件5學時）（1）質粒改造的策略18第18頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（2）一個合格質粒的組成要素5學時）復制起始位點Ori：控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復制起始點；而真核生物DNA分子有多個復制起始位點抗生素抗性基因：便于對目的基因的檢測，如Ampr、Kanr多克隆位點MCS：克隆攜帶外源基因的片段P/E（Promoter/Enhancer）：啟動子/增強子T（Terminator）：終止信號poly(A)加尾信號：穩(wěn)定mRNA19第19頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四5.質粒的分類人工構建的質粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質粒突變拷貝數(shù)控制基因，拷貝數(shù)1000-3000，擴增基因低拷貝質粒來自pSC101，拷貝數(shù)小于10，表達某些毒性基因溫敏質粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質測序質粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合質粒裝有整合促進基因及位點，便于外源基因的整合穿梭質粒裝有針對兩種不同受體的復制子，便于基因克隆表達質粒裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件探針質粒裝有報告基因，便于啟動子等元件的克隆篩選5學時）20第20頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四215學時）第21頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四6.如何閱讀質粒圖譜5學時）22第22頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四RBS：ribosome-bindingsite原核RBS：SDsequence真核RBS：Kozaksequence5學時）23第23頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四7.重要的大腸桿菌質粒載體松弛型復制（1）pBR322氯霉素可擴增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆5學時）24第24頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（2）pUC18/19拷貝數(shù)：2000-3000/cell用于基因克隆和測序多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’：E.colilacZ基因的5’端序列，表達半乳糖苷酶的α片段。LacZ’的上游包括乳糖操縱子上的啟動子Plac和操縱基因O。5學時）25第25頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四265學時）第26頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四pUC18/19的正選擇標記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷（IPTG）X-gal5學時）27第27頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四藍白斑篩選pUC18/19質粒上的LacZ基因包括一段β-半乳糖苷酶的啟動子、編碼α肽鏈的區(qū)段、一個多克隆位點(MCS)。MCS位于編碼α肽鏈的區(qū)段中，是外源DNA的選擇性插入位點，但其本身不影響載體編碼α肽鏈的功能活性。當菌體中含有帶lacz‘的質粒后，質粒lacz’基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補，具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用，使X-gal生成藍色物質，這種現(xiàn)象即α-互補。用這種質粒進行克隆時，如果外源基因破壞了LacZ的編碼序列，所產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物就會喪失α-互補能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成無色菌斑，可用于重組子的篩選。5學時）28第28頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四標志補救（?-半乳糖苷酶法）lacZ’AmprN2H片段COOH片段lacZ5學時）29第29頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（LacZ’基因序列）插入片段（LacZ’基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶5學時）30第30頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（3）pGEM-3Z多拷貝裝有兩個噬菌體的強啟動子，用于外源基因的高效表達裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等5學時）31第31頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四8.質粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質粒DNA氯化銫密度梯度離心法

質粒DNA純度高；但周期長，設備要求高，存在溴乙錠污染。堿裂解法質粒DNA純度低；優(yōu)點是快速、操作簡便。沸水浴法

質粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴之間5學時）32第32頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（1）氯化銫密度梯度離心法

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAsocDNA：開環(huán)DNAL-DNA：線狀DNA5學時）33第33頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（2）堿裂解法

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內含物加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除蛋白質乙醇或異丙醇沉淀水相質粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNAcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA5學時）34第34頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四溶液I：調節(jié)pH，懸浮菌體，抑制DNase的活性溶液II：裂解細胞膜（主要是NaOH），臨用前配制，SDS是為沉淀染色體DNA作準備溶液III：中和NaOH，促進SDS沉淀蛋白質和基因組DNA詳見/77/article/i8082-p2.html5學時）35第35頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四5學時）36第36頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四5學時）37第37頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（3）沸水浴法用含有EDTA和TritonX-100的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁沸水浴40秒離心，用無菌牙簽挑去沉淀物乙醇或異丙醇沉淀質粒DNA5學時）38第38頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（二）噬菌體或病毒DNA噬菌體（phage）或病毒（virus）是一類非細胞微生物，能高效率、高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉化。噬菌體或病毒的上述特性使得其DNA能被開發(fā)成為基因工程的載體，因為：高效率的感染性能，使外源基因高效導入受體細胞自主復制繁殖性能，使外源基因在受體細胞中高效擴增5學時）39第39頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四1.大腸桿菌的λ噬菌體DNA噬菌體是比細菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細胞一樣，噬菌體侵犯細菌，也可以認為它是細菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結構上有一個蛋白質外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內。5學時）40第40頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四(1)λ噬菌體的生物學特性l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因生物結構5學時）415’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’

COSCOS第41頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四感染周期E.coli吸附LamB受體注入復制包裝裂解5學時）42100個左右的拷貝體內包裝野生型l-DNA本身長度為48.5kb，包裝范圍為原DNA的75-105%，即36-51kb。第42頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種狀態(tài)稱為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩個基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關閉又取決于宿主細胞本身的性質。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細胞的性質，使噬菌體或處于溶原狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)。DNA重組技術一般需要l噬菌體進入溶菌狀態(tài)。5學時）43第43頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四λ噬菌體從溶原轉為裂解是一種可誘導過程。誘導的因素可能很多，實驗室常用的是熱誘導:某些λ噬菌體，在低溫時（30℃）保持溶原狀態(tài)，在高溫（42℃）時進入溶菌狀態(tài)。這些λ噬菌體的cl基因是溫度敏感突變型的，稱為c1ts。λclts1857，可作為組件插入質粒DNA內。目的基因插在λclts1857下游，重組體的目的基因在42℃表達，30℃不表達。這種方法稱為熱誘導表達，使用的是溫敏開關。5學時）44第44頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（2）λDNA載體的構建野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此需要縮短野生型l-DNA的長度，才能提高裝載量。其實，野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解非必需的。在構建載體時，這些片段可以刪除。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體和取代型載體。①縮短長度5學時）45第45頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大小0-14kb5學時）46通過特定的酶切位點允許外源DNA片段插入的載體稱為插入型載體（insertionvectors）。由于λ噬菌體對所包裝的DNA有大小的限制，因此一般插入型載體設計為可插入6kb長的外源DNA片段，最大14kb。第46頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四取代型載體：必須有外源基因片段的插入體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（36-26）kb載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（51-26）kb5學時）47插入位點體外包裝第47頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四②刪除重復的酶切位點野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除多余的酶切位點，每種限制酶只保留1-2個位點。同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點。除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術去除或增添限制酶位點。5學時）48第48頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四③加裝選擇標記與質粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標記，因此加裝選擇標記是l-DNA克隆載體構建的重要內容。5學時）49Imm434標記imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標記基因的l-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當外源DNA插入到標記基因中，基因滅活，l-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑。第49頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四lacZ標記lacZ基因編碼b-半乳糖苷酶的α片段，與b-半乳糖苷酶的片段互補，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。當外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍色化合物，形成白色噬菌斑；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍色噬菌斑。X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷,是β-半乳糖苷酶的顯色底物IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，半乳糖的類似物，是乳糖操縱子的誘導物。5學時）50第50頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四④構建琥珀密碼子的突變體琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物——校正tRNA能專一性地糾正這一突變。構建策略：將野生型l-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白基因序列中的CAG密碼子突變成UAG。當這種l-DNA進入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散。基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。5學時）51第51頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（3）λ-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體：lgt10、lgt11取代型載體：lEMBL4、Charon405學時）52第52頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（4）λDNA重組分子的體外包裝l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞。用于體外包裝的蛋白質可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進行。任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染，均不能產(chǎn)生有感染力的噬菌體顆粒，這是基于安全考慮而設計的。5學時）53第53頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（5）λDNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。加入λ噬菌體或重組λ噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時。用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時。這時噬菌體顆粒密度可達1013-1014/L，而大腸桿菌細胞已完全裂解。超速離心，沉淀噬菌體。苯酚抽提，釋放λ-DNA。

乙醇或異丙醇沉淀λ-DNA。

5學時）54第54頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（6）λ-DNA作為載體的特點l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌。l-DNA載體的裝載能力可達25kb，遠遠大于質粒的裝載量。重組l-DNA分子的篩選較為方便。重組l-DNA分子的提取較為簡便。l-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因。5學時）55第55頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四2.大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNA（1）M13噬菌體的生物學特性M13噬菌體的外型呈絲狀M13噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成M13DNA全長6407個核苷酸M13DNA上至少有10個基因2700個外殼蛋白分子M13噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長5學時）56正鏈DNA第56頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（2）M13DNA載體的構建IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker復制DNA(replicationformDNA，RFDNA)

5學時）57第57頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（3）M13DNA載體的特點使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外（因為M13噬菌體只包裝正鏈），這在DNA定向突變中非常有用。M13重組分子篩選簡便：被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大。但是，M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb。5學時）58第58頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四動植物細胞作為受體細胞時，一般選擇相應動植物的病毒基因組DNA作為載體。動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結構，可將動植物病毒分成四大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復制時大多存在相應的DNA中間反應物，這些中間體可作為載體用于DNA重組實驗。3.病毒DNA載體5學時）59第59頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（三）考斯質粒(cosmid)與噬菌粒(phagemid)l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb。但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質粒和噬菌粒載體的構建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA上與包裝有關的序列和質粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構建考斯質粒和噬菌粒載體的思路。注意：考斯質粒和噬菌粒不攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內不能形成噬菌體顆粒。5學時）60第60頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四1.考斯質粒（cosmid）（1）考斯質粒載體的構建考斯質粒是一類人工構建的含有l(wèi)-DNAcos序列和質粒復制子的特殊類型的載體。1978年Collins和Hohn發(fā)明構建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAmprPstIBamHISalIcossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為30-45kbpHC795學時）61第61頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（2）考斯質粒載體的特點能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易不能體內包裝，不裂解受體細胞5學時）62第62頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四2.噬菌粒（phagemidorphasmid）（1）噬菌粒載體的特點噬菌粒是一類人工構建的含有單鏈噬菌體的包裝序列、復制子以及質粒的復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體。能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉染受體細胞

裝載量比常規(guī)的M13mp系列載體要大很多（10kb）能像質粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單鏈DNA5學時）63第63頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（2）重要的噬菌粒載體pUC118：pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119：pUC19+M13間隔區(qū)IG500個拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAmprM13-IGpUC118/119表示M13輔助噬菌體：為噬菌粒提供基因II產(chǎn)物和包裝蛋白，使其能夠合成單鏈DNA。

①pUC118/1195學時）64第64頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四②pBluescript：體外轉錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAmprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動子PT3和PT7強化外源基因的轉錄。提取出來的單鏈DNA重組分子，在噬菌體RNA聚合酶的存在下，可實現(xiàn)外源基因的體外轉錄。f1-ori：線狀噬菌體復制起始區(qū)5學時）65第65頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（四）人造染色體載體人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時考斯質粒和噬菌粒載體的裝載量也遠遠不能滿足需要。將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）5學時）66第66頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四1.細菌人造染色體BacterialArtificialChromosome，BAC細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子—F質粒的基礎上構建的。裝載量：50kb-300kb拷貝數(shù)：各種類型的BAC在大腸桿菌受體菌中只能維持單一拷貝。BAC主要適用于：

①克隆大型基因簇（genecluster）②構建動植物基因文庫（genelibrary）5學時）67第67頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四2.酵母人造染色體YeastArtificialChromosome(YAC)（1）酵母人造染色體的組成pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAmprTRP1ARS1兩個來自嗜熱四膜蟲的末端重復序列(TEL)：保持重組YAC為線狀結構酵母染色體的著絲粒序列(centromere4,CEN4)酵母選擇標記：URA3、TRP1大腸桿菌的復制子：ori大腸桿菌的選擇標記：AmprYAC載體的裝載量為350kb-400kb酵母染色體的復制子(autonomouslyreplicating

sequence，ARS

)5學時）68克隆位點：EcoRI。該位點位于酵母菌Sup4tRNA基因內。Sup4基因編碼產(chǎn)物抑制赭色表型(成為白色)。如果用不含外源DNA片段的pYAC4載體轉化酵母菌，轉化子的菌落呈白色。而帶有插入的外源DNA片段的pYAC4重組載體，其Sup4已經(jīng)失活，結果轉化酵母菌后所產(chǎn)生的轉化子形成赭色菌落。這種插入失活選擇標記的應用，大大簡化了陽性克隆工作。第68頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（2）酵母人造染色體的使用pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉化酵母菌重組酵母染色體在利用pYAC4載體克隆DNA片段時，要將pYAC4載體線性化，分離純化帶有染色體末端序列的兩個臂，同時分離純化大分子DNA片段，連接后用于轉化酵母菌感受態(tài)細胞。5學時）69TargetDNA第69頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四5學時）70第70頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四

二、用于基因轉移的受體菌或細胞5學時）各種基因工程受體的特性實驗室常用的基因工程受體受體細胞應具備的條件71第71頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四作為基因工程的受體細胞，應利于外源DNA的轉化或轉導，同時又要有較好的安全性。野生型的大腸桿菌并不是理想的受體細胞，因其自身具有限制和修飾系統(tǒng)，對未經(jīng)甲基化處理的外源DNA分子有一定的降解作用，導致外源DNA的轉化或轉導效率低下。此外，野生型大腸桿菌對其他生物種群可能存在潛在的致病性。因此必須通過適當?shù)恼T變手段對野生型大腸桿菌進行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細胞的突變菌株。5學時）72第72頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四（一）受體細胞應具備的條件限制性缺陷型：外切酶和內切酶活性缺陷（hsdR-）重組整合缺陷型：用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-，

recB-，recC-

）具有較高的轉化效率具有與載體選擇標記互補的表型感染寄生缺陷型：防止重組細菌擴散污染（生物武器除外）。5學時）73第73頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四限制與修飾系統(tǒng)限制與修飾系統(tǒng)是維持野生型細菌種屬特異性的保護系統(tǒng)，其限制與修飾作用分別由限制性核酸內切酶和修飾甲基化酶來完成。當外源DNA分子進入細菌細胞內部時，限制系統(tǒng)產(chǎn)生限制作用，將來自不同生物的外源DNA分子或重組DNA分子降解破壞。而對于自身DNA分子則由修飾系統(tǒng)加以甲基化修飾，免于限制系統(tǒng)的限制作用。這是導致外源重組DNA轉化或轉導效率低下的主要原因之一。應選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細胞，以提高外源DNA分子的轉化或轉導效率。大腸桿菌的限制系統(tǒng)主要由hsdR基因控制，因此具有hsdR-遺傳表型的大腸桿菌菌株均喪失了降解外源DNA的能力，大大增加了外源DNA的可轉化性，轉化效率可提高1000倍左右。若進一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子的多種基因操作。5學時）74第74頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四重組系統(tǒng)在野生型細菌中，進入細胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體DNA發(fā)生體內同源重組反應，該重組反應由rec基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。其中RecA是一個單鏈蛋白，在同源重組過程中起著不可替代的作用，它能促進DNA分子之間的同源聯(lián)會和DNA單鏈交換，recA基因的突變使大腸桿菌細胞內的遺傳重組頻率降低至10-6。同樣,recB、recC和recD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率。因此受體細胞必須選擇體內同源重組缺陷型的遺傳表型，其相應的基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。5學時）75第75頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四易于轉