《DB32T 3979-2021實驗用 斑馬魚 飼育技術(shù)條件》

ICS07.080

CCSA40

32

江蘇省地方標(biāo)準

DB32/T3979—2021

實驗用斑馬魚飼育技術(shù)條件

Technicalrequirementsforbreedinglaboratoryzebrafish

2021-02-03發(fā)布2021-03-03實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局??發(fā)布

DB32/T3979—2021

II

DB32/T3979-2021

實驗用斑馬魚飼育技術(shù)條件

1范圍

本文件規(guī)定了《實驗用斑馬魚飼育技術(shù)條件》的飼育魚房工藝布局、飼育設(shè)施、飼育環(huán)境條件、

飼育密度與餌料及飼喂、繁育和遺傳資源保存、倫理維護以及質(zhì)量規(guī)范。

本文件適用于實驗用斑馬魚的飼育。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準

GB/T18883室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準

GB/T31962污水排入城鎮(zhèn)下水道水質(zhì)標(biāo)準

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

斑馬魚胚胎zebrafishembryo

未出殼膜的斑馬魚胚胎，一般指0dpf~3dpf（dayspostfertilization；受精后天數(shù)）的斑馬魚

胚胎。

3.2

斑馬魚仔魚zebrafishlarva

出殼膜后至發(fā)育到未成為幼魚之前的斑馬魚，一般指4dpf~28dpf的斑馬魚。

3.3

斑馬魚幼魚juvenilezebrafish

外部形態(tài)與成魚相似但未性成熟的斑馬魚，一般指29dpf~84dpf的斑馬魚。

3.4

成年斑馬魚adultzebrafish

性成熟、具備繁殖能力的斑馬魚。一般指年齡大于84dpf的斑馬魚。

4飼育魚房工藝布局

4.1飼育魚房總體要求

獨立空間，凈高度不宜低于250cm；地面防潮、防水、防滑、耐沖擊、平整；墻壁光滑、耐潮、不

吸水、抗擊碰性損壞、無縫隙。

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4.2飼育魚房功能分區(qū)

包括去離子水制備區(qū)、循環(huán)系統(tǒng)流水處理區(qū)、飼育區(qū)、餌料生產(chǎn)區(qū)、儲存區(qū)、清潔區(qū)、隔離區(qū)和實

驗區(qū)。

4.2.1去離子水制備區(qū)

將符合GB5749《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準》要求的水進行反滲處理制備成去離子水的區(qū)域，可位于飼

育魚房外獨立空間。

4.2.2循環(huán)系統(tǒng)流水處理區(qū)

對飼育用水進行過濾、紫外消毒、充氣、pH調(diào)節(jié)和電導(dǎo)率調(diào)節(jié)等集中區(qū)，可獨立于飼育魚房外。

4.2.3飼育區(qū)

日常繁育斑馬魚的飼育區(qū)應(yīng)配備流水飼育設(shè)施飼育仔魚、幼魚與成年魚；配備靜水飼育設(shè)施飼育胚

胎、仔魚以及用于親魚繁育。

4.2.4餌料生產(chǎn)區(qū)

包括培育開口餌料草履蟲的草履蟲生產(chǎn)區(qū)和孵化豐年蟲幼蟲的豐年蟲卵孵化區(qū)。分別配置供培育草

履蟲的容器和供孵化豐年蟲卵的專用孵化設(shè)備。

4.2.5儲存區(qū)

配備冰箱存放斑馬魚餌料。

4.2.6清潔區(qū)

設(shè)有清潔用水池以及魚撈等漁具存放區(qū)。

4.2.7隔離區(qū)

外來的斑馬魚應(yīng)飼養(yǎng)在獨立于日常繁育飼育區(qū)之外的隔離區(qū)，胚胎經(jīng)消毒處理后方可進入日常繁育

飼育區(qū)。

4.2.8實驗區(qū)

進行實驗處理的斑馬魚應(yīng)飼育在獨立于斑馬魚日常繁育飼育區(qū)外的實驗區(qū)，可位于飼育魚

房外的實驗室內(nèi)。

僅為完成遺傳改造而實施過顯微注射的斑馬魚胚胎或僅用于簡單顯微形態(tài)學(xué)觀測以評估

質(zhì)量的斑馬魚可回到日常繁育飼育區(qū)。

所有經(jīng)實驗處理的斑馬魚（包括胚胎、仔魚、幼魚和成魚）不應(yīng)回到日常繁育飼育區(qū)。完

成實驗后通常需要進行安樂死。

5飼育設(shè)施

5.1流水飼育系統(tǒng)

5.1.1飼育架

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應(yīng)由不銹鋼或其它防水防銹等無毒材料制成，層距不低于35cm。

5.1.2飼育缸

材質(zhì)要求無毒、無害、無放射性、耐腐蝕、耐高溫、耐高壓、耐沖擊、易清洗、易消毒滅

菌。

飼育缸由飼育蓋板、飼育缸體以及飼育后插板組成。

飼育蓋板設(shè)餌料投喂孔、流水單管孔和備用孔。

飼育缸體配有雙卡槽，可同時插入防仔魚和幼魚逃逸后插板以及導(dǎo)污后插板。

5.1.3循環(huán)凈化設(shè)備

包括過濾處理單元、水體循環(huán)設(shè)備、消毒單元、充氣補氧單元、PLC自動化控制集成單元、給排水

分配單元、生物凈化水槽、系統(tǒng)流量監(jiān)控單元、pH控制單元和電導(dǎo)率控制單元。

5.2靜水飼育系統(tǒng)

5.2.1飼育架

同5.1.1。

5.2.2交配缸

內(nèi)外膽結(jié)構(gòu)，材料要求與飼育缸（5.1.2）一致；內(nèi)膽底部高于外盒底部2cm，并配有分離隔板和

蓋板。

5.2.3飼育缸

同5.2.2，但無內(nèi)膽和分離隔板。

6飼育環(huán)境條件

6.1溫度

室溫23℃~30℃，24h內(nèi)變動不超過2.5℃。水溫25℃~29℃，24h內(nèi)變動不超過1.0℃。

6.2濕度

相對濕度為45%~70%。

6.3空氣

空氣質(zhì)量符合GB/T18883《室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準》。另需有新風(fēng)輸入，至少每4h~5h輸入1次，每

次空氣交換量是整體空間的2倍體積。

6.4環(huán)境噪音

低于70dB。

6.5光照

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采用14h光照10h黑暗的方式飼養(yǎng)。光照時間內(nèi)，飼育魚房內(nèi)和魚缸水面光照強度均為54lx~

324lx。

6.6飼育用水

6.6.1電導(dǎo)率

450μS/cm~550μS/cm。

6.6.2pH

pH6.5~pH8.0。

6.6.3氨氮

含量＜0.02mg/l。

6.6.4鹽度

含量為0.3‰~0.5‰。

6.6.5亞硝酸鹽

含量＜0.2mg/l。

6.6.6硝酸鹽

含量＜5mg/l。

6.6.7溶解氧

含量為5mg/l~8mg/l。

6.6.8二氧化碳

含量為＜5mg/l。

6.6.9硬度

50mg/l~100mg/l。

6.7流水循環(huán)速度

小于10dpf的仔魚所在魚缸的水流速度應(yīng)小于10ml/min，10dpf至28dpf仔魚所在魚缸的水流速

度為50ml/min~80ml/min，幼魚和成魚魚缸水流速度100ml/min~150ml/min。

6.8日換水量

6.8.1日排水量為系統(tǒng)總水量的2%~10%，根據(jù)系統(tǒng)中所負荷魚量適當(dāng)增加。

6.8.2日常繁育斑馬魚的飼育用水符合GB/T31962《污水排入城鎮(zhèn)下水道水質(zhì)標(biāo)準》，可直接排

入城鎮(zhèn)下水道。

6.8.3實驗區(qū)內(nèi)用于斑馬魚實驗處理的飼育用水應(yīng)按照生物類實驗室的要求處理，不應(yīng)直接排入

城鎮(zhèn)下水道。

7飼育密度與餌料及飼喂

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7.1飼育密度

7.1.1胚胎飼育密度

10ml飼育用水飼育的胚胎數(shù)不超過50枚。

7.1.2仔魚飼育密度

4dpf~17dpf仔魚的飼育密度不超過40尾/l、大于18dpf的仔魚飼育密度不超過20尾/l。

7.1.3幼魚飼育密度

不超過6尾/l。

7.1.4成魚飼育密度

5尾/l。

7.2飼育餌料

7.2.1斑馬魚餌料包括草履蟲活體和豐年蟲幼蟲活體，可自行培育或購買。

7.2.2草履蟲培育方法見附錄A。培育出的草履蟲活體直接用于斑馬魚仔魚的飼喂。

7.2.3豐年蟲幼蟲孵化方法見附錄B。孵化出的幼蟲經(jīng)脫鹽處理后用于斑馬魚的飼喂。

7.3飼喂

7.3.1飼喂總則

斑馬魚的每日飼喂次數(shù)為2次~4次。

7.3.2飼喂量

發(fā)育時期為4dpf~6dpf仔魚，每次按草履蟲1×105個/l~3×105個/l投喂。發(fā)育時期

為7dpf~10dpf仔魚，以草履蟲和豐年蟲幼蟲混合喂飼，草履蟲每次投喂密度為3×105個/l~

5×105個/l，豐年蟲為1×104個/l~4×104個/l，依發(fā)育時間逐步提高豐年蟲比例。發(fā)魚時期為

11dpf~28dpf仔魚，以豐年蟲幼蟲飼喂，飼喂量為約3×104個/l~4×104個/l。

幼魚每次投喂豐年蟲幼蟲5×104個/l~9×104個/l。

成魚每次投喂豐年蟲幼蟲1×105個/l~3×105個/l。

8繁育和遺傳資源保存

8.1繁育安排

使用交配缸進行斑馬魚交配繁育。親本的雌雄比例為雌2尾雄1尾~2尾，一個交配缸內(nèi)最多不超過

7尾魚。

8.2新創(chuàng)制遺傳資源保存

根據(jù)國家斑馬魚資源中心的要求填寫相關(guān)表格，向國家斑馬魚資源中心遞交新創(chuàng)制的基因組改造的

詳細遺傳信息；同時遞交新創(chuàng)制的基因型和遺傳背景明確的斑馬魚成魚，用于國家斑馬魚資源中心保存。

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9倫理維護

9.1福利保障

應(yīng)制定斑馬魚使用與管理的具體規(guī)章制度；不應(yīng)執(zhí)行任何不符合動物倫理學(xué)規(guī)范的斑馬魚使用與管

理方案。

9.2飼育人員技能

斑馬魚生產(chǎn)與使用人員應(yīng)在上崗前接受專業(yè)培訓(xùn)，了解斑馬魚繁殖生物學(xué)的基本知識、飼育規(guī)范以

及使用與管理規(guī)范等。

9.3生長記錄

記錄每日的水溫、室溫、濕度、飼喂、清潔、整理、魚缸清洗、受精卵收集、草履蟲飼育和豐年蟲

幼蟲孵化情況等。

9.4標(biāo)識

黏貼在飼育缸或交配缸外的斑馬魚標(biāo)簽的信息應(yīng)包括：動物的受精日期、基因型和傳代代數(shù)等內(nèi)容。

9.5安樂死

將斑馬魚置于冰水混合物中快速預(yù)冷2min后，放入-20℃冰箱凍存。斑馬魚安樂死后應(yīng)及時轉(zhuǎn)移

至飼育魚房外的專用斑馬魚尸體存放冰箱的冷凍室中凍存，集中進行無害化處理。

10質(zhì)量規(guī)范

10.1實驗用斑馬魚來源

實驗用斑馬魚的遺傳背景應(yīng)該明確。不應(yīng)飼育遺傳背景不明的斑馬魚；不應(yīng)使用來源于寵物市場的

斑馬魚。

10.2胚胎的質(zhì)量

應(yīng)具備與發(fā)育時期一致的正常的顯微形態(tài)學(xué)特征。

10.3仔魚的質(zhì)量

10.3.1應(yīng)從殼膜中孵出，具正常的顯微形態(tài)學(xué)特征，可在水中自由游泳。

10.3.24dpf仔魚魚鰾的后部腔室開始充氣。約20dpf，仔魚魚鰾的前部腔室開始充氣。約

21dpf時，魚鰾前后兩個腔室的充氣完成。

10.4幼魚與成魚的質(zhì)量

10.4.1健康的斑馬魚應(yīng)保持充分放松的姿態(tài)以與水面平行的方式在水中游泳。

10.4.2斑馬魚的正常行為包括均勻的呼吸（通過活動鰓蓋）、以及保持對游泳和捕食運動的興趣。

10.4.3斑馬魚生病的特征包括體重與體長的比例下降、急促的呼吸、明顯的身體組織的損傷（潰

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瘍、外傷）、以及體色、體型和運動方式等的改變。當(dāng)斑馬魚急速翻身、向一側(cè)傾斜、或者與水面

垂直也可以作為生病的特征。

10.4.4表現(xiàn)出異于正常斑馬魚行為的基因組改造斑馬魚突變體，不應(yīng)視作病魚。

10.4.5生病的斑馬魚通常要進行及時的安樂死。

10.4.6如果病魚十分珍貴，可將病魚轉(zhuǎn)移至隔離區(qū)隔離治療。

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A

A

附錄A

（資料性）

草履蟲培育

在3l缸中加入0.1g氯化鈉（分析純）和約5粒大麥粒，倒入1.5l~2l煮沸去離子水后混勻，放

置室溫待用，待溶液降至室溫后加入0.1g酵母粉搖勻備用，吸取母液10%作為種子液，加入混合好的新

鮮培養(yǎng)液中，室溫下培養(yǎng)1周，于體視顯微鏡下檢測培養(yǎng)效果，一般可達到2,000個/ml的草履蟲，此時

可直接使用。3周~4周后需利用種子液，再行培養(yǎng)新鮮草履蟲。

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B

B

附錄B

（資料性）

豐年蟲幼蟲孵化及脫鹽處理

豐年蟲幼蟲是通過購買市售的豐年蟲休眠卵孵化而來。孵化使用符合GB5749《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)

準》要求的市政自來水配制的溶液完成。孵化溶液含鹽量（使用50目以下的細海鹽或孵化專用海鹽）為

1.5%~2.5%；pH8.0~pH8.2（使用NaHCO3調(diào)節(jié)pH）；蟲卵密度為3g/l；孵化溫度為25℃~30℃；孵化

時間為24h~30h。

孵化時，位于溶液底部設(shè)有充氣裝置，保證豐年蟲休眠卵處于懸浮狀態(tài)。

孵化完成后，拔去充氣管，靜置沉降10min~15min，此時豐年蟲幼蟲會沉至孵化器下部，打開孵

化器下部閥門即可收集孵化出的豐年蟲幼蟲。但此時因為鹽度太高還不能直接投喂，需要通過同樣的靜

置沉降的方法再將收集到的豐年蟲幼蟲用去離子水或流水系統(tǒng)飼育用水洗滌4次后，方可投喂斑馬魚。

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參考文獻

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與質(zhì)量控制》（征求意見稿）（含實驗用魚第1部分：遺傳質(zhì)量控制；第二部分：病原學(xué)等級及監(jiān)測；

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及監(jiān)測》、DB11/T1053.3-2013《實驗用魚第3部分：遺傳質(zhì)量控制》、DB11/T1053.4-2013《實驗用

魚第4部分：病理學(xué)診斷規(guī)范遺傳質(zhì)量控制》、DB11/T1053.5-2013《實驗用魚第5部分：配合飼料技

術(shù)要求》、DB11/T1053.6-2013《實驗用魚第6部分：環(huán)境條件》。北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局2013-12-20

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