CN116478894B 一種提高唾液酸乳糖產量的基因工程菌及其生產方法 （江南大學）

oligosaccharides,3'-sialyl一種提高唾液酸乳糖產量的基因工程菌及本發明公開了一種提高唾液酸乳糖產量的2并異源表達編碼乙酰神經氨酸合成酶的neuB基因、編碼N一乙酰葡萄糖胺異構酶的neuC基所述UDP乙酰葡糖胺合成途徑為葡萄糖胺6磷酸合成酶編碼基因glmS、葡萄糖胺合所述α2,3唾液酸轉移酶基因選自多殺性巴氏桿菌Pasteurellamultocida的基因突編碼基因glmS、葡萄糖胺合成酶編碼基因glmM和UDP一乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因所述乳糖轉移酶編碼基因lacY的核苷酸序列如SEQIDNO:所述葡萄糖胺6磷酸合成酶編碼基因glmS、葡萄糖胺合成酶編碼基因glmM和UDP乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因glmU的核苷酸序列分別如SEQIDNO.7～SEQIDNO.9所所述基因突變體Pm0188*的核苷酸序列如SEQIDNO.1并異源表達編碼乙酰神經氨酸合成酶的neuB基因、編碼N一乙酰葡萄糖胺異構酶的neuC基所述UDP乙酰葡糖胺合成途徑為葡萄糖胺合成酶編碼基因glmM和UDP乙酰葡萄糖胺所述α2,6唾液酸轉移酶基因選自鰒發光桿菌Photobacteriumleiognathi的基因突glmM和UDP乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因gl3所述乳糖轉移酶編碼基因lacY的核苷酸序列如SEQIDNO.所述葡萄糖胺合成酶編碼基因glmM和UDP一乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因glmU的核苷酸序列分別如SEQIDNO:8～SEQIDN所述谷氨酰胺合成酶編碼基因glnA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所述基因突變體plst6*的核苷酸序列如SEQIDNO.1編碼基因glmS、葡萄糖胺合成酶編碼基因glmM和UDP一乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因所述α2,3唾液酸轉移酶基因選自多殺性巴氏桿菌Pasteurellamultocida的基因突所述基因lacY的核苷酸序列如SEQIDNO:所述葡萄糖胺6磷酸合成酶編碼基因glmS、葡萄糖胺合成酶編碼基因glmM和UDP乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因glmU的核苷酸序列分別如SEQIDNO:7～所述基因glnA的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；所述基因突變體Pm0188*的核苷酸glmM和UDP乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因gl所述α2,6唾液酸轉移酶基因選自鰒發光桿菌Photobacteriumleiognathi的基因突所述基因lacY的核苷酸序列如SEQIDNO:所述葡萄糖胺合成酶編碼基因glmM和UDP一乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因glmU的所述基因glnA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所述基因突變體plst6*的核苷酸序列如SEQIDNO.146.權利要求1或2所述基因工程菌，或權利要求3_5任一項所述的方法在生產唾液酸乳糖及含有唾液酸乳糖的產品中的應用。5過調節腸—腦軸支持正常的微生物群落和應激期間的行為反應。因此采用母乳喂養的嬰[0004]目前關于生物發酵制備唾液酸乳糖，以2008年EricSamain等通過敲除nanT、2010年該課題組以同樣方法構建6'_SL路徑，僅將3'_SL從頭合成路徑中的α_2,3唾液酸轉6[0010]在一種實施方式中，所述UDP_乙酰葡糖胺合成途徑為葡萄糖胺_6_磷酸合成酶編碼基因glmS、葡萄糖胺合成酶編碼基因glmM和/或UDP_乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因果糖激酶編碼基因pfkA和/或葡萄糖胺_6磷酸脫氨酶編碼萄糖胺合成酶基因glmM、UDP_乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶基因glmU和谷氨酰胺合成酶基因[0019]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0020]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0021]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0022]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0023]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0024]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0025]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0026]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、7[0027]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0028]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0029]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0038]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0039]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0040]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0041]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0042]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0043]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、8[0044]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、[0052]在一種實施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1質粒表達基因neuB、neuC、neuA和glnA，利用pCOLADuet_1質粒表達基因lacY、α_2,6唾液酸轉移酶基因，利用[0054]在一種實施方式中，所述編碼α_2,3唾液酸轉移酶基因Pm0188、突變體基因Pm0188*、來源于海藻百伯坦菌Bibersteiniatrehalosi的基因[0055]在一種實施方式中，所述編碼α_2,6唾液酸轉移酶基因選自來源于光桿菌Photobacteriumsp.的基因pst6_224、來源于鰒發光桿菌Photobacteriumleiognathi的基因plst6、突變體基因plst6*來源于美人魚發光桿菌Photobacteriumdamselae的基因9萄糖胺焦磷酸化酶基因glmU和谷氨酰胺合成酶基因gln1過表達葡萄糖胺_6_磷酸合成酶編碼基因glmS、葡萄糖胺合成酶編碼基因glmM和/或UDP_[0065]在一種實施方式中，利用pETDuet_1或pACYCDuet_1過表達neuB基因、neuC基因、neuA基因和基因glnA，利用pRSFDuet_1或pCOLADuet_1過表達基因lacY和編碼唾液酸轉移碼基因glmM和/或UDP_乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶編碼基因gl[0069]在一種實施方式中，待初始碳源消耗完后，流加600～850g/L甘油和15～25g/酸乳糖及含有唾液酸乳糖的產品中的應用。[0075]本發明通過乙酰神經氨酸合成酶基因neuB、N一乙酰葡萄糖胺異構酶基因neuC、CMP唾液酸合成酶基因neuA、α2,3唾液酸轉移酶基因lst和/或α2,6唾液酸轉移酶基因同時，通過表達基因glnA(編碼谷氨酰胺合成酶)建立谷氨酰胺循環調控前體物質葡萄糖[0088]HPLC檢測條件：示差折光檢測器；色譜柱為RezexROA_organicacid[0090]挑取LB固體培養基上過夜培養的工程菌菌落接種于5mLLB液體培養基中，37℃、200r/min下培養12h作為種子液。按照1％(v/v培養基中，37℃、200r/min下培養至菌體OD600值為0.6～0.8，加入IPTG使其終濃度為[0095]利用CRISPR_Cas9基因敲除系統敲除大腸桿菌BL21(DE3)基因組中lacZ、nanA、[0096](1)以E.coliBL21(DE3)基因組DNA為模板，利用引物對lacZ_up_F/R和lacZ_通過SOE_PCR技術將上下游片段擴增連接起來獲得基因同源修復臂donor_lacZ、donor_[0097](2)以pTargetF質粒(Addgene:#62226)為模板，以lacZ_sg_F/R、nanA_sg_F/R、(即帶有lacZ、nanA、pfkA和nagB特異性N20序列的靶向質粒pTargetF_lacZ、pTargetF_[0098](3)冰上放置E.coliBL21(DE3)感受態細胞解凍10min，取5μLpCas質粒于冰上2～3min。加入1mL新鮮LB液體培養基，30℃、200r/min培養1h后，3500r/min離心養至長出E.coliBL21(DE3)[0100](5)將pTargetF_lacZ質粒(總量500ng)和基因同源修復臂donor_lacZ(總量1μg)[0101](6)將步驟(5)測序驗證敲除成功的陽性克隆菌落培養于含有卡那霉素的LB液體股份有限公司合成來源于空腸彎曲桿菌Campylobacterjejuni的neuB、neuC、neuA基因序列，來源于腦膜炎奈瑟球菌Neisseriameningitidis的lst基因序列，來源于光桿菌Photobacteriumsp.的pst6_224基因序列。[0113]以合成的pst6_224基因片段為模板，以pst6_224_F/pst6_224_R為引物擴增出(南京諾唯贊生命科技有限公司)分別連接到質粒pRS_lst和pRS_pst6的NdeI/XhoI酶切位[0118](3)根據唾液酸乳糖代謝合成路徑中的關鍵基因將步驟(1)獲得的質粒pET_BCA和[0121]模塊的表達量值由啟動子的力度和質粒拷貝數共同決定。本實施例使用的5個質基因片段neuA分別連接到質粒pRS_BC、pCD_BC、pAC_BC和pCO_BC的NdeI/XhoI酶切位點之[0123]利用實施例2的構建方法將基因片段lst和pst6_224分別連接到載體pETDuet_1、[0124]以CMP_唾液酸為模塊化節點，將代謝合成途徑分為兩個模塊，模塊上游基因為程菌(即菌株BC1)和含有重組質粒pAC_BCA和pCO_PY的工程菌(即菌株BK15)分別獲得了NanT酶可逆運輸。乙酰甘露糖胺和唾液酸的可用性對唾液酸乳糖的合成效率存在一定影合成酶)和glmU(編碼UDP_乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶)，在UDP_乙酰葡糖胺的產生中是至關構建方法將回收的glmS、glmM和glmU基因片段通過無縫克隆試劑盒(南京諾唯贊生命科技有限公司)分別連接到載體pCDFDuet_1的NcoI/BamHI酶切位點之間，獲得質粒pCD_glmS、[0134]以大腸桿菌BL21(DE3)Δ(DE3)ΔlacZΔnanAΔpfkAΔnagB。將實施例4中的質粒組合分別轉化至敲除菌株BL21Pst6_224(蛋白質ID：BAF92026.1)，Plst6(蛋白質ID：BAI49484.1)和Bst(蛋白質ID：BAA25316.1)及其突變體PM0188*(R313N/T265S)、Nst*(I411T/L433T)、Plst6*(ΔN2_15生工生物工程(上海)股份有限公司合成來源于多殺性巴氏桿Pm0188和Pm0188*基因序列，來源于海藻百伯坦菌Bibersteiniatrehalosi的WQG基因序Photobacteriumleiognathi的plst6和plst6*基因序列以及