SNT 5872-2025 出口食品中諾如病毒和甲肝病毒檢測方法 實時熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法（實時熒光RT-RAA法）標(biāo)準(zhǔn)立項發(fā)展報告

出口食品中諾如病毒和甲肝病毒檢測方法實時熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法（實時熒光RT-RAA法）標(biāo)準(zhǔn)立項發(fā)展報告EnglishTitle:StandardizationDevelopmentReport:DetectionMethodforNorovirusandHepatitisAVirusinExportedFoods-Real-timeFluorescenceReverseTranscriptionRecombinase-AidedAmplification(Real-timeFluorescenceRT-RAA)摘要關(guān)鍵詞中英文關(guān)鍵詞-中文關(guān)鍵詞：出口食品；諾如病毒；甲肝病毒；實時熒光RT-RAA；檢測方法；行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；食品安全；口岸檢疫-英文Keywords：ExportedFoods;Norovirus;HepatitisAVirus;Real-timeFluorescenceRT-RAA;DetectionMethod;IndustryStandard;FoodSafety;PortQuarantine正文一、引言食品安全是全球關(guān)注的焦點問題，關(guān)乎公眾健康、貿(mào)易秩序與社會穩(wěn)定。病毒性食源性疾病是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的食源性疾病之一。其中，諾如病毒（Norovirus,NoV）和甲肝病毒（HepatitisAVirus,HAV）是導(dǎo)致人類急性胃腸炎和急性肝炎的兩大主要病原體。這兩種病毒主要通過糞-口途徑傳播，具有感染劑量低、環(huán)境穩(wěn)定性高、可在食品中持續(xù)存活等特點。貝類（如牡蠣）、漿果、色拉用蔬菜、即食食品等因易受污染，常成為病毒傳播的載體。對于我國而言，作為全球最大的食品出口國之一，出口食品的安全質(zhì)量直接關(guān)系到國家信譽(yù)、企業(yè)利益和國際貿(mào)易的順利進(jìn)行。近年來，歐盟、美國、日本等主要貿(mào)易伙伴國對我國出口食品中的病毒殘留監(jiān)管日趨嚴(yán)格，屢次因諾如病毒或甲肝病毒污染問題觸發(fā)預(yù)警通報，甚至導(dǎo)致貿(mào)易壁壘。傳統(tǒng)的病毒檢測技術(shù)，如細(xì)胞培養(yǎng)法、電子顯微鏡法和RT-qPCR法，均存在明顯局限性。例如，細(xì)胞培養(yǎng)法耗時長且NoV難以體外培養(yǎng)；電子顯微鏡法靈敏度低、設(shè)備昂貴；RT-qPCR法則需要精密的熱循環(huán)儀和專業(yè)實驗室，難以滿足口岸一線快速、便捷、高通量的現(xiàn)場檢測需求。鑒于上述挑戰(zhàn)，開發(fā)一種適用于口岸實際、操作簡便、結(jié)果可靠且成本可控的快速檢測方法顯得尤為迫切。實時熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增技術(shù)（Real-timeFluorescenceReverseTranscriptionRecombinase-AidedAmplification,簡稱實時熒光RT-RAA）應(yīng)運而生。該技術(shù)模擬了細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和重組的過程，利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶，在恒定溫度（通常37-42℃）下即可實現(xiàn)核酸的指數(shù)級擴(kuò)增，并通過熒光探針實時監(jiān)測擴(kuò)增過程，實現(xiàn)了對靶標(biāo)核酸的定性或定量檢測。其核心優(yōu)勢在于無需復(fù)雜的溫度循環(huán)設(shè)備，檢測時間通常可縮短至15-30分鐘，且靈敏度可與RT-qPCR相媲美。正是在此技術(shù)成熟和行業(yè)需求的雙重驅(qū)動下，海關(guān)總署組織相關(guān)技術(shù)機(jī)構(gòu)啟動了SN/T5872-2025《出口食品中諾如病毒和甲肝病毒檢測方法實時熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法（實時熒光RT-RAA法）》的編制工作。本標(biāo)準(zhǔn)是首次將實時熒光RT-RAA技術(shù)正式納入我國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)體系，為出口食品中病毒污染的快速篩查提供了標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)依據(jù)。二、標(biāo)準(zhǔn)立項背景與必要性2.1行業(yè)緊迫需求-口岸通關(guān)效率要求：生鮮食品（如冷凍莓果、冰鮮水產(chǎn)品）保質(zhì)期短，對通關(guān)速度要求極高。傳統(tǒng)檢測方法從采樣到出結(jié)果往往需要4-6小時甚至更久，嚴(yán)重制約了貨物周轉(zhuǎn)。RT-RAA技術(shù)可將檢測周期縮短至1小時內(nèi)，顯著提升口岸放行效率。-監(jiān)管技術(shù)升級需求：隨著國際貿(mào)易技術(shù)壁壘（TBT）的不斷變化，對檢測技術(shù)的靈敏度、特異性、抗干擾能力和便攜性提出了更高要求。現(xiàn)有國標(biāo)和行標(biāo)多基于RT-qPCR，缺乏針對恒溫擴(kuò)增這一新興主流技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。-打破貿(mào)易壁壘需求：主要貿(mào)易伙伴國（如歐盟、美國）已在其官方監(jiān)測中廣泛應(yīng)用等溫擴(kuò)增技術(shù)作為初篩手段。我國制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，有助于實現(xiàn)技術(shù)對標(biāo)，提升檢測結(jié)果的國際互認(rèn)度，減少貿(mào)易摩擦。2.2技術(shù)發(fā)展的成熟性實時熒光RT-RAA技術(shù)自被提出以來，經(jīng)過多年的優(yōu)化與驗證，在技術(shù)原理、引物探針設(shè)計、試劑配方、儀器微型化等方面均已趨于成熟。大量研究表明，該方法在復(fù)雜食品基質(zhì)（如貝類組織、植物葉片、油脂）中的核酸提取與擴(kuò)增抑制控制方面取得了突破性進(jìn)展，其靈敏度和特異性已得到充分驗證，具備了標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)基礎(chǔ)。2.3現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)體系的補(bǔ)充完善我國目前關(guān)于食品中病毒檢測的標(biāo)準(zhǔn)主要有GB4789系列和SN/T系列，主要以RT-qPCR和普通PCR方法為主。這些標(biāo)準(zhǔn)在病毒確證和定量方面發(fā)揮著重要作用，但在應(yīng)對口岸大量、快速篩查場景時存在短板。SN/T5872-2025的立項，正是在原有的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法體系之外，引入了一種適用于現(xiàn)場快速檢驗（POCT）的補(bǔ)充方法，完善了我國出口食品病毒檢測的標(biāo)準(zhǔn)層級，實現(xiàn)了從“實驗室確證”到“口岸快篩”的完整覆蓋。三、標(biāo)準(zhǔn)核心技術(shù)內(nèi)容解讀SN/T5872-2025標(biāo)準(zhǔn)為首次制定，其核心是建立一套基于實時熒光RT-RAA技術(shù)，用于檢測出口食品中諾如病毒（GI型和GII型）和甲肝病毒RNA的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。其主要技術(shù)內(nèi)容包括：3.1適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口貝類、漿果類、生鮮蔬菜類及其他可能受病毒污染的即食食品中諾如病毒和甲肝病毒的定性檢測。明確指出適用于口岸查驗、生產(chǎn)加工企業(yè)自檢及監(jiān)管部門監(jiān)督抽檢。3.2檢測原理本標(biāo)準(zhǔn)基于以下技術(shù)原理：在恒溫條件下（39℃），利用逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，重組酶（Recombinase）與引物結(jié)合形成蛋白-核酸復(fù)合物，在輔助蛋白作用下，識別并解開雙鏈DNA模板。單鏈結(jié)合蛋白（SSB）穩(wěn)定生成的單鏈區(qū)域，具有鏈置換活性的DNA聚合酶隨即從引物3‘端開始延伸，合成新的DNA鏈。通過引物對和熒光標(biāo)記探針，在擴(kuò)增過程中不斷產(chǎn)生可被檢測的熒光信號，實現(xiàn)實時監(jiān)測。3.3關(guān)鍵試劑與耗材標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)規(guī)定了試劑要求，包括但不限于：-引物與探針：針對NoVGI、NoVGII、HAV的保守區(qū)域（如NoV的RdRp區(qū)、HAV的VP1/2A區(qū)），設(shè)計了高特異性引物和帶有熒光基團(tuán)（如FAM）與猝滅基團(tuán)的探針。-酶體系：包含重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、具有鏈置換活性的BsuDNA聚合酶（大片段）和逆轉(zhuǎn)錄酶。-核酸提取試劑盒：要求使用能夠有效去除食品中多糖、蛋白質(zhì)、脂類及RT-RAA抑制劑的試劑盒，并給出了推薦產(chǎn)品和自配方法。3.4操作步驟標(biāo)準(zhǔn)對操作流程作了嚴(yán)格規(guī)定，主要包括：1.樣品前處理：針對不同食品基質(zhì)（如貝類去殼取消化腺和鰓、漿果直接勻漿、蔬菜剪碎），規(guī)定了具體的樣品重量、洗脫液體積和勻漿條件。2.病毒濃縮與核酸提取：采用聚乙二醇（PEG）沉淀法或超濾離心法濃縮病毒顆粒，隨后進(jìn)行核酸提取與純化。3.實時熒光RT-RAA反應(yīng)：在0.2mL或0.5mL反應(yīng)管中配制反應(yīng)體系，加入模板核酸。置于恒溫?zé)晒鈾z測儀中，設(shè)置39℃反應(yīng)30分鐘，同時進(jìn)行熒光采集（如FAM通道）。標(biāo)準(zhǔn)明確給出了陽性對照（含靶標(biāo)RNA的質(zhì)粒或滅活病毒）、陰性對照（無核酸酶水）和內(nèi)部擴(kuò)增對照（IAC）的設(shè)置要求。4.結(jié)果判讀：采用兩個標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定：-定性判讀：在擴(kuò)增曲線呈典型“S”型，且Ct值（擴(kuò)增曲線上各點熒光強(qiáng)度達(dá)到儀器設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)，此處指時間閾值）在有效范圍內(nèi)（例如≤20分鐘），則判定為陽性。-內(nèi)部對照判讀：所有樣本的IAC必須正常擴(kuò)增，以排除因核酸提取失敗或擴(kuò)增抑制導(dǎo)致的假陰性。四、標(biāo)準(zhǔn)的特點與創(chuàng)新1.快速高效：從樣品前處理到出具結(jié)果，整個流程可在2-3小時內(nèi)完成，相比RT-qPCR法（通常需4-6小時）效率提升50%以上，滿足口岸現(xiàn)場“即采即檢”需求。2.操作簡便：無需復(fù)雜的熱循環(huán)設(shè)備，只需要一臺恒溫?zé)晒鈾z測儀（或普通水浴鍋+熒光檢測設(shè)備），操作人員經(jīng)過短期培訓(xùn)即可掌握，降低了對高端實驗室和資深技術(shù)人員的依賴。3.高靈敏性與特異性：通過精心設(shè)計的引物和探針，以及對反應(yīng)體系的優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)方法對諾如病毒和甲肝病毒的檢測限可達(dá)到103copies/g（克）以下，與RT-qPCR在同一數(shù)量級，特異性達(dá)到100%。4.抗污染能力強(qiáng)：實時熒光RT-RAA采用封閉管反應(yīng)，減少了氣溶膠污染的風(fēng)險。同時，標(biāo)準(zhǔn)引入了內(nèi)部擴(kuò)增對照，進(jìn)一步提高了結(jié)果的可靠性。5.兼容性好：該方法可與多種商品化的核酸提取試劑盒和便攜式恒溫?zé)晒鈾z測儀配套使用，具有良好的通用性和可擴(kuò)展性。五、主要參與單位介紹——中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心SN/T5872-2025標(biāo)準(zhǔn)的制定凝聚了我國出入境檢驗檢疫領(lǐng)域頂尖科研機(jī)構(gòu)的智慧與力量，其中，中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心（簡稱海科中心）作為核心起草單位，發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心是海關(guān)總署直屬的正局級事業(yè)單位，是我國海關(guān)系統(tǒng)最高級別的專業(yè)技術(shù)支撐機(jī)構(gòu)。其主要職能包括：開展進(jìn)出境安全風(fēng)險評估與預(yù)警研究、承擔(dān)海關(guān)系統(tǒng)重大科研攻關(guān)任務(wù)、負(fù)責(zé)海關(guān)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)與管理、提供執(zhí)法結(jié)果的復(fù)核與仲裁檢測、開展國際技術(shù)交流與規(guī)則協(xié)調(diào)等。在食品微生物與病毒檢測領(lǐng)域，海科中心擁有國家級重點實驗室——食品安全檢測實驗室，配備有世界一流的設(shè)施設(shè)備，包括全自動核酸提取工作站、高通量測序儀、數(shù)字PCR儀、多模式酶標(biāo)儀及各類等溫擴(kuò)增分析儀等。該中心長期致力于口岸食品中病毒污染的監(jiān)測、溯源與快速檢測技術(shù)研究，在諾如病毒、甲肝病毒、戊肝病毒以及輪狀病毒等食源病毒的分子流行病學(xué)和快速診斷方法開發(fā)方面積累了豐富經(jīng)驗。在本標(biāo)準(zhǔn)的編制過程中，海科中心牽頭承擔(dān)了以下關(guān)鍵任務(wù)：1.技術(shù)路線論證：聯(lián)合多家實驗室，對實時熒光RT-RAA技術(shù)原理進(jìn)行深入剖析，比較不同等溫擴(kuò)增技術(shù)（如LAMP、RCA、HDA等）在復(fù)雜食品基質(zhì)中的表現(xiàn)，最終確定了RAA技術(shù)作為最適合口岸快檢的方案。2.引物探針設(shè)計優(yōu)化：基于全球現(xiàn)有病毒的基因序列庫，通過生物信息學(xué)分析，設(shè)計了覆蓋NoVGI、NoVGII和HAV主要流行株的簡并引物和特異性探針，并通過大量的實際樣本驗證其廣譜性和特異性。3.方法學(xué)驗證：組織全國多個口岸海關(guān)實驗室開展實驗室間比對驗證。使用人工污染樣品和自然污染樣品，系統(tǒng)評估了方法的靈敏度、特異性、重現(xiàn)性、檢出限、抗干擾性及穩(wěn)定性，為本標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性提供了堅實的實驗數(shù)據(jù)支撐。4.標(biāo)準(zhǔn)文本撰寫與協(xié)調(diào)：負(fù)責(zé)編制標(biāo)準(zhǔn)草案、編制說明、意見匯總處理表等全套立項與報批材料。積極與全國食品進(jìn)出口標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAC/TC444）溝通，協(xié)調(diào)解決標(biāo)準(zhǔn)制定過程中的技術(shù)爭議，確保了標(biāo)準(zhǔn)文本的質(zhì)量。海科中心的深度參與，不僅保證了標(biāo)準(zhǔn)在技術(shù)層面的領(lǐng)先性和權(quán)威性，更為標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后的宣貫培訓(xùn)、方法推廣、能力驗證等后續(xù)工作奠定了堅實基礎(chǔ)，充分體現(xiàn)了國家級技術(shù)機(jī)構(gòu)的責(zé)任與擔(dān)當(dāng)。六、結(jié)論與展望SN/T5872-2025《出口食品中諾如病毒和甲肝病毒檢測方法實時熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法（實時熒光RT-RAA法）》的正式發(fā)布與實施，是我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)中的一個重要里程碑。它成功地將成熟的等溫擴(kuò)增技術(shù)轉(zhuǎn)化為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，為出口食品中病毒污染的快速、現(xiàn)場、即時檢測提供了權(quán)威的技術(shù)規(guī)范。該標(biāo)準(zhǔn)不僅能夠有效解決傳統(tǒng)檢測方法周期長、依賴高端設(shè)備、難以普及等痛點，顯著提升口岸一線監(jiān)管的科技含量和執(zhí)法效能，更能幫助企業(yè)提升自身品質(zhì)控制能力，降低貿(mào)易風(fēng)險。展望未來，本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展與推廣可從以下幾個方面深化：1.向多靶標(biāo)聯(lián)檢發(fā)展：探索在一次反應(yīng)中同時檢測NoV、HAV、戊肝病毒等多種食源病毒的多重RT-RAA檢測方法，提高檢測通量和性價比。2.向便攜化、集成化發(fā)展：與微流控芯片、生物傳感器等技術(shù)結(jié)合，開發(fā)集核酸提取、擴(kuò)增、檢測于一體的“樣品進(jìn)-結(jié)果出”全集成式檢測設(shè)備，實現(xiàn)真正的掌上式現(xiàn)場即時檢測（POCT）。3.向數(shù)字化、智能化發(fā)展：建立基于云平臺的實時熒光RT-RAA