T∕CHATA 066-2026 預防用重組卡介苗（rBCG）的小鼠結核模型評價技術規范

預防用重組卡介苗(rBCG)的小鼠結核模型評價技術規范2026-08-03發布2026-09-03實施中國防癆協會發布I 1范圍 2規范性引用文件 3術語和定義 4縮略語 25小鼠結核模型制備 5.1模型制備 5.2模型驗證 6.1疫苗免疫及劑量優化 6.2疫苗免疫原性評價：細胞免疫 46.3疫苗免疫原性評價：體液免疫 47rBCG安全性評價 7.1總則 7.2安全性評價的設計與內容 8rBCG保護性評價 8.1非致死劑量感染模型評價 68.2致死劑量感染模型評價 79生物安全要求 7附錄A(資料性)小鼠結核模型制備和驗證 附錄B(資料性)肺臟、脾臟單細胞分離及FCM染色 附錄C(資料性)ELISA方法檢測血清IgG 附錄D(資料性)安全性評價 本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規本文件由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所、中國醫學科學院病首都醫科大學附屬北京胸科醫院、中國醫學科學院醫藥生物技術1本文件適用于在符合生物安全等級要求的實驗室內開展rBCG在小鼠結核模型中的評價。下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489—2008實驗室生物安全通用要求GB14925—2023實驗動物環境及設施GB/T35892—2018實驗動物福利倫理審查指南為預防、控制疾病的發生、流行，用于人體免疫接種，能夠誘機體在長期種系進化過程中形成的、與生俱來的非特異性防御能力，由適應性免疫adaptiveimmunity機體在接觸特定抗原后產生的、由B淋巴細胞和T淋巴細胞介導的特異性免疫應答，具有抗3.64縮略語ABSL-3:動物生物安全三級實驗室(AnimBSL-1:生物安全一級實驗室(BiosafetyLevel1Laboratory)GLP:藥物非臨床研究質量管理規范(GoodLaborSPF:無特定病原體級動物(SpecificPathogenFreeAnimal)3應使用SPF級6周～8周齡小鼠，同一批次實驗宜使用同性別小鼠。小鼠隨機分組，每組數量應使用Mtb標準菌株(如H37Rv)。菌株培養制備方法詳見附錄A.1.2。模型制備方法詳見附錄A.1.3。Mtb感染小鼠后選擇合適時間(比如4周),安樂死并解剖小鼠，無菌取出的小鼠肺、脾組織Mtb感染后選擇合適時間(比如4周)的小鼠肺、脾組織，觀察是否有結核結節樣病變。顯微鏡下觀察肺組織有無結核菌感染引起的炎性細胞浸潤情況，且抗酸染色能否檢測出Mtb;脾臟組織白髓區生發中心是否有不規則破壞等病理改變，詳見附錄A.3.3。6疫苗免疫原性評價免疫途徑：皮下注射為基本途徑。若疫苗設計有特殊要求(如黏膜免疫),可根據實際情況rBCG的特異性記憶性T細胞、Th1/Th2免疫反應相關細胞因子、體液免疫的抗體IgG以及淋根據疫苗作用原理選擇合適時間進行檢測，比如小鼠免疫72小時、1周及4周后采用流式細胞術(FlowCytometry,FCM)分別檢測肺、脾臟單細胞懸液中的固有免疫細胞，包括NK細胞、單核細胞、樹突狀細胞等固有免疫細胞的絕對值及百分比，評價疫苗誘導的早期及后期固有免疫應答。詳見附錄B。檢測各組小鼠初始T細胞、效應T細胞、記憶Th1/Th2/Th17相關細胞因子水平，綜合評價rBCG誘導的適應性免疫應答。詳見附錄B。應將BCG陽性對照組(一般為已上市的標準BCG疫苗)分別與溶媒對照組進行比較，如有統計學差異，證明實驗系統穩定可靠；不同劑量rBCG組分別與溶媒對照組、親本BCG對照組、BCG陽性對照組進行比較，以Th1免疫應答相關指標判定rBCG免疫原性差異，并檢驗是否具有以Th1免疫反應相關指標(如IFN-y、IL-2)為例，結果判定分為以下兩種情況：(1)IFN-y和IL2的表達水平顯著升高，與溶媒對照組和親本BCG對照相比，組間差異具有(2)IFN-γ和IL2的表達無顯著差異，與溶媒對照組和親本BCG對學意義，則rBCG疫苗的特異性免疫原性弱。根據疫苗作用原理選擇合適時間進行檢測，比如小鼠免疫72小時、1周及4周等時間點，采采用流式細胞術檢測B細胞亞群，綜合評估rBCG誘導的體液免疫應答。5靠；不同劑量rBCG組分別與溶媒對照組、親本BCG對照組、BCG陽性對照組進行比較，以IgG抗體水平判定rBCG免疫原性差異，并檢驗是否具有統計學意義。詳見附錄C。以C57BL/6小鼠IgG2c/IgG1比值判定(1)IgG2c/IgG1>1,與溶媒對照組和親本BCG對照組相比差異有統計學意義，提示疫苗以(2)IgG2c/IgG1<1,與溶媒對照組和親本BCG對照組相比差異有統計學意義，提示疫苗以綜合Th1型細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2)、記憶T細胞亞群分布及IgG2c/IgG1比值，全應在符合藥物非臨床研究質量管理規范(GoodLaborato實驗設計、檢測指標(如常規指標、血液學指標、病理學指標),詳見附錄D。(1)感染模型對照組：僅進行病原菌攻毒，不做免疫處理；(2)陰性對照組：給予溶媒或PBS,不進行免疫及攻毒感染；(3)陽性對照組：免疫已上市的標準BCG疫苗后，再進行病原菌攻毒感染；(4)親本BCG對照：免疫rBCG的親本疫苗后，再進行病原菌攻毒感染；(5)受試rBCG疫苗組：設置多個梯度劑量的rBCG疫苗免疫組，完成免疫后統一進行病原菌(1)組織荷菌量；詳見附錄A.2.2。(2)組織病理學檢測；詳見附錄A.3.2和A.3.3。(3)免疫學指標檢測，包括記憶性T細胞、Th1/Th2型細胞因子等；詳見附錄B。將感染模型對照組與陰性對照組進行統計學分析，若兩組組織荷菌量、病計學意義，判定感染模型構建成功；再將BCG陽性對照組與感染模型將各劑量rBCG實驗組分別與感染模型對照組、親本BCG對照組、陰性對照組進行統計學分1)荷菌量顯著下降、病理損傷明顯改善(P<0.05):判定為具有保護作用；4)荷菌量與病理損傷均無顯著改變(P≥0.05):判定為無保護作用。對初步判定具備保護作用的rBCG組別，進一步與BCG陽性對照組(已上市的標準BCG疫苗)開展統計學比較：1)各項指標組間無統計學差異：判定rBCG相對市售標準BCG疫苗具有非劣效性；7不同劑量rBCG組、親本BCG對照、陰性對照或BCG陽性對照(已上市標準BCG)免疫小鼠。免疫時間根據疫苗作用原理確定,比如免疫4周后,通過氣溶膠途徑給予致死劑量Mtb攻毒。持續記錄小鼠存活率與生存時間,并繪制生存曲線。首先進行模型驗證:感染模型對照組與陰性對照組相比,存活率、生存時間存在統計學差異,提示模型構建成功;陽性對照組與感染模型對照組相比差異顯著,證明試驗體系穩定。將各rBCG劑量組分別與感染模型對照組、親本BCG對照、陰性對照組比較,判定保護效果:1)存活率顯著提高、生存時間延長(P<0.05),判定為具有保護作用;將具備保護作用的rBCG組與BCG陽性對照組對比:組間無統計學差異則判定為非劣效;若35892—2018實驗動物福利倫理審查指南和中國藥典三部(涉及生物制品檢定、無菌檢查的相關內容)的要求。9.3含菌組織應用不少于10倍體積的10%中性福爾馬林固定，固定時間不少于72小時，且確保固定液充分滲透組織內部,經確認滅活后方可轉移至BSL-1實驗室進行后續處理。本文件涉及的動物實驗宜經所在機構實驗動物倫理委員會審查批準主要設備：二級生物安全柜A2型或以上、恒溫培養箱、分光光度計、肺部液體定量霧化器主要試劑耗材：無菌PBS、中性羅氏培養基或含10%OADC的7H10平板、異氟烷、菌液。A.1.2模型制備選用的菌株及制備方法H37Rv菌株接種于固體培養基(中性羅氏培養基或含10%OADC的7H10),37℃培養3周~4周至菌落成熟后收集。使用玻璃研磨器或組織研磨儀在生物安全柜內進行研磨，操作時避免產生氣溶膠。研磨后靜置5分鐘使大顆粒沉降。然后經5μm濾器過濾，用pH7.2的PBS(0.01稀釋涂板，37℃培養3周~4周后計數CFU,確認實際感染劑量。確認結果應在試驗記錄中注明。1)麻醉使用異氟烷麻醉機2%～5%異氟烷將小鼠麻醉，以小鼠呼吸平穩、無自主活動、無2)感染小鼠仰臥位固定在小動物操作臺上，然后把小動物喉鏡從小鼠口中放入幫助肺部液體定量霧化器進入小鼠氣管將50μLMtb溶液霧化進行氣溶膠感染。感染后，將小鼠置于恢復籠中，保持溫暖，待完全清醒后放回原飼養籠，密切觀察24小時內有無異常反應。主要試劑耗材：中性羅氏培養基或含10%OADC的7H10平板、無菌PBS、涂菌棒、移液91)取組織小鼠感染MtbH37Rv標準株后，選擇合適時間(比如4周)對其進行安樂死，無菌取肺組織、脾組織依次在生理鹽水、4%H?SO?和生理鹽水進行漂洗，然后置于預冷的無菌2)研磨使用組織研磨儀充分研磨制備肺組織、脾組織勻漿。3)稀釋組織勻漿液連續十倍梯度稀釋。5)計數37℃培養，3周后首次觀察菌落生長情況，4周后進行終末計數。計數時選取菌落數在30～300之間的稀釋梯度進行統計。6)做圖并進行統計學分析。主要設備：二級生物安全柜A2型或以上、組織脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機。主要試劑耗材：10%福爾馬林、固定缸、載玻片、蓋玻片、蘇木素-伊紅染色液、75%乙醇，85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠。小鼠安樂死后，取出肺臟、脾臟組織，觀察組織表面有無結節、肉芽腫樣病變，剪開觀察組小鼠感染MtbH37Rv標準株后，選擇合適時間(比如4周)實施安樂死。取小鼠肺組織、脾組織，將肺組織、脾組織用10%福爾馬林固定72小時后從ABSL-3實驗室轉出到BSL-1實驗室。固定液體積應為組織體積的10倍以上，確保固定液充分滲透。隨后組織進行脫水、包埋、切片、HE染色。通過顯微鏡下觀察炎性細胞浸潤情況，抗酸染色鑒定組織內的Mtb;脾臟白髓區生發中心有無不規則破壞。如果觀察到肺實變和脾白髓破壞，抗酸染色可見Mtb,且組織荷菌量提示50mg膠原酶IV溶于100μLHanks溶液中，混勻后以Hanks溶液定容至50mL,終濃度11)肺組織置于10mL膠原酶消化液中，37℃水浴振蕩(100rpm～120rpm)消化20分鐘~30分鐘；3)5mL紅細胞裂解液重懸，室溫孵育5分鐘，加10mLPBS終止，2000rpm離心5分鐘，1)通過機械研磨獲得單細胞懸液，無需酶消化。脾臟組織置于70μm篩網上進行研磨，獲取2)PBS清洗濾網，2000rpm離心5分鐘，棄上清；3)5mL紅細胞裂解液重懸沉淀，室溫孵育5分鐘，加10mLPBS終止裂解，2000rpm離心5分鐘，棄上清；4)PBS重懸，臺盼藍染色計數，取1×10?個活細胞進行流式染色。1)胞內細胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等)檢測前需細胞激活刺激：取1×10?細胞于培養板中，加入細胞刺激混合物(如PMA50ng/mL、離子霉素1μg/mL)和蛋白轉運抑制劑(如布雷菲爾德菌素A或莫能霉素),37℃、5%CO?孵育4小時~6小時。刺激結束后收集細胞進行3)表面染色后，用固定液室溫避光固定30分鐘，4℃保存待測。1)取1×10?細胞于流式管內；3)[可選步驟]根據實驗需求對細胞懸液進行Fc(如抗小鼠CD16/CD32抗體)受體封閉，減4)按照抗體說明書加熒光標記抗體染細胞表面標志分子，4℃避光孵育30分鐘；6)加入1mL1×固定緩沖液，渦旋混勻，4℃避光孵育30分鐘，1mL1×破膜緩沖液清洗1500rpm離心5分鐘，棄上清；7)2mL1×破膜緩沖液重懸細胞，渦旋混勻，4℃避光孵育30分鐘，1500rpm離心5分鐘，8)按照抗體使用說明書加核內染色抗體，混勻后室溫避光孵育30分鐘；9)加入2mL1×破膜緩沖液，1500rpm離心5分鐘，棄上清；將純化的Mtb特異性抗原(如結核菌素純蛋白衍生物，PPD)以1μg/mL用包被緩沖液稀釋后，按照100μL/孔加入酶標板孔中，通常4℃孵育12小時～18小時，使抗原吸附在孔底。C.2封閉棄去包被液并洗滌后，加入封閉液300μL/孔(如5%脫脂奶粉/PBS溶液)以封閉孔板上未結合的非特異性位點，減少背景干擾。棄去包被液，用PBST(含0.05%Tween-20的PBS)洗滌3次，每次300μL/孔，靜置30秒～60秒后棄去。加入封閉液300μL/孔(如5%脫脂奶粉/PBS溶液或1%BSA/PBS溶液),37℃孵育1小時~2小時或4℃孵育過夜，以封閉孔板上未結合的非特異性位點。根據預實驗確定的抗體滴度，使用PBS溶液對血清進行適當稀釋(推薦起始稀釋倍數為1:100、1:200、1:400等系列稀釋)。建議每個樣本設置2～3個稀釋度，以確保檢測值落在標準陰性對照：未免疫小鼠血清(同品系、周齡);陽性對照：以已上市的標準BCG免疫小鼠血清(經ELISA驗證為強陽性),分裝后-80℃保存，每次實驗使用同一批次對照血清。C.4加樣加入稀釋好的待檢血清100μL/孔(以及陰、陽性對照),37℃孵育1小時，建議使用微孔板振蕩器低速振蕩(300rpm～500rpm)以保證血清中的特異性抗體與固相抗原均勻結合。PBST洗板3次。加入酶(如辣根過氧化物酶，HRP)標記的抗鼠IgG抗體100μL/孔(使用PBS或封閉液按PBST洗板5次，每次300μL/孔，靜置30秒～60秒后棄去，最后一次洗滌后在吸水紙上拍C.6顯色與終止洗滌后加入酶的底物(如TMB)100μL/孔，室溫避光反應10分鐘～20分鐘，進行顯色。以陽性對照孔顯色明顯(OD?50值達到1.0～1.5)、陰性對照孔無明顯顯色為顯色終止的判斷依據。顯色后加入終止液(2mol/LH?SO?)50μL/孔終止反應。終止反應后30分鐘內完成酶標儀通過與標準曲線比較，計算出樣品中目標抗體的濃度。標準曲線是通過使用已知濃度的抗體C.7.1抗體滴度測定(推薦) 如需測定抗體絕對濃度，應使用商品化小鼠IgG標準品建立標準曲線，同時檢測待測樣本。標準曲線R2≥0.99,待測樣本OD?50值應落在標準曲線線性范圍內。1)將BCG陽性對照組(已上市標準BCG)與感染模型對照組、陰性對照組進行比較，若BCG組抗體滴度顯著高于對照組(P<0.05),證明實驗系統穩定可靠；1)陰性對照孔OD?50值≤0.10;2)陽性對照孔OD?50值≥1.00;3)空白孔(無血清、無二抗)OD?50值≤0.05。(資料性附錄)1)一般毒理學研究通常使用已有大量歷史對照數據，來源、品系、遺傳背景清楚的正常動物開展，通常不需要開展單獨的幼齡動物研究。宜選擇對疫苗所預防的病2)必要時可選擇疾病模型動物開展試驗。可根據臨床擬用人群確定動物周齡。3)每個劑量每種性別一般不少于15只動物(如主試驗組10只，恢復期5只)。1)安全藥理學試驗通常結合重復給藥毒性試驗開展。2)可應用小鼠評價疫苗對中樞神經系統和呼吸系統等的影響，檢測時間范圍應涵蓋疫苗的體1)急性毒性信息可在重復給藥毒性試驗中進行評估，通常不需要開展常規的單次給藥毒性試2)重復給藥毒性試驗的給藥次數通常比臨床免疫多一次，給藥間隔應依據動物體內免疫應答3)研究至少設置兩個給藥劑量，劑量范圍應包括最大人用劑量。4)試驗中應重點關注免疫功能指標(包括體液和/或細胞免疫應答檢測)、免疫器官的組織5)常規檢測指標包括臨床癥狀觀察、體重、攝食量、眼科檢查、血液學檢查、血生化檢查等。6)末次給藥后，應設置至少4周恢復期，以了解毒性反應的可逆性和可能出現的遲發毒性。分別在給藥結束和恢復期結束時進行系統的大體剖檢，稱重主要臟定主要臟器進行組織病理學檢查。需稱重并計算臟器系數的器官包括：腦、心臟、肝臟、腎臟、腎上腺、胸腺、脾臟、睪丸、附睪、卵巢、子宮；需要進行組織病理學檢查的組織或器官包括：腎上腺、主動脈、骨(股骨)、骨髓(胸骨)、腦(至少3個水平)、盲腸、結腸、子宮和子宮頸、十二指腸、附睪、食管、眼、膽囊、哈氏腺、心臟、回腸、空腸、腎臟、肝臟、肺臟(含主支氣管)、淋巴結(一個與給藥