ISO 6888-22021Amd 12023 食物鏈微生物學凝固酶陽性葡萄球菌（金黃色葡萄球菌和其他種類）計數的水平方法第2部分使用兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基的方法修改1標準立項發展報告

食物鏈微生物學凝固酶陽性葡萄球菌（金黃色葡萄球菌和其他種類）計數的水平方法第2部分：使用兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基的方法修改1StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofcoagulase-positivestaphylococci(Staphylococcusaureusandotherspecies)—Part2:Methodusingrabbitplasmafibrinogenagarmedium—Amendment1摘要食品安全是公共衛生領域的核心議題，而凝固酶陽性葡萄球菌（包括金黃色葡萄球菌及其他相關菌種）作為引發食源性疾病的重要病原微生物，其準確、高效的檢測與計數方法在全球食品安全監管體系中占據關鍵地位。國際標準ISO6888-2:2021規定了采用兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基對食物鏈中凝固酶陽性葡萄球菌進行水平計數的方法，而ISO6888-2:2021/Amd1:2023作為該標準的修改1，于2023年9月發布，對原標準中的關鍵技術環節進行了修訂完善。本報告系統梳理了該修改單的立項背景、技術內容、修訂要點及其對食品微生物檢測領域的深遠影響。報告指出，該修改單的發布進一步提升了凝固酶陽性葡萄球菌檢測方法的準確性、可重復性和實驗室間可比性，回應了食品微生物檢測技術發展的最新需求，對完善我國食品安全標準體系、促進食品國際貿易具有重要的參考價值和指導意義。關鍵詞：凝固酶陽性葡萄球菌；金黃色葡萄球菌；兔血漿纖維蛋白原瓊脂；食品微生物學；國際標準修改；水平計數方法；食品安全檢測Keywords:Coagulase-positivestaphylococci;Staphylococcusaureus;Rabbitplasmafibrinogenagar;Foodmicrobiology;Internationalstandardamendment;Horizontalenumerationmethod;Foodsafetytesting1引言1.1研究背景食品安全是關系人民群眾身體健康和生命安全的重要民生問題。世界衛生組織（WHO）數據顯示，全球每年約有6億人因食用受污染的食品而生病，其中約42萬人死亡。在眾多食源性致病微生物中，凝固酶陽性葡萄球菌（Coagulase-positivestaphylococci,CPS）是一類不可忽視的重要病原菌群，其代表性菌種——金黃色葡萄球菌（*Staphylococcusaureus*）——是引發細菌性食物中毒的常見病原體之一。金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然界中，可在食品加工、儲存和流通的各環節污染食品。其在適宜條件下可產生多種腸毒素，其中以A型和B型腸毒素最為常見，人體攝入含足量腸毒素的污染食品后，經過1至6小時的潛伏期即出現惡心、劇烈嘔吐、腹痛、腹瀉等急性胃腸炎癥狀。由于金黃色葡萄球菌在食品中的污染具有普遍性和隱蔽性，建立準確、標準化的檢測和計數方法對于保障食品安全至關重要。1.2標準修訂的必要性ISO6888-2標準是國際食品微生物檢測領域公認的權威方法標準，其第2部分規定了采用兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基（RPFA）對凝固酶陽性葡萄球菌進行計數的水平方法。該標準在全球范圍內被廣泛采用，是各國食品安全監管機構、食品生產企業及第三方檢測實驗室開展相關檢測工作的重要技術依據。然而，隨著食品微生物檢測技術的持續進步和行業實踐經驗的不斷積累，原標準中的部分技術內容已不能完全滿足當前檢測工作的實際需求。具體而言，檢測人員在長期應用過程中發現，部分環節的操作細節有待進一步明確，某些試驗條件對特定類型食品基質的適用性存在改進空間。此外，實驗室間比對研究（interlaboratorystudies）的結果也揭示了不同實驗室在執行原標準時可能出現的結果偏差，這在一定程度上影響了檢測結果的可比性和一致性。在上述背景下，國際標準化組織食品委員會（ISO/TC34）下屬的食品微生物學分技術委員會（SC9）組織相關國際專家對ISO6888-2:2021進行了系統評審和修訂，最終形成了ISO6888-2:2021/Amd1:2023修改單。該修改單的發布實施，是國際食品微生物檢測標準體系持續完善的重要體現。1.3標準基本信息本報告所涉修改單的標準編號為ISO6888-2:2021/Amd1:2023，由國際標準化組織（ISO）于2023年9月12日正式發布。該標準歸屬于ISO/TC34/SC9（食品微生物學分技術委員會）歸口管理，標準類別為食品微生物學檢測方法標準，現行有效。標準原文以英語發布，可供全球各成員國直接采用或轉化為本國標準。2標準技術內容概述2.1標準適用范圍ISO6888-2標準適用于食品和動物飼料中凝固酶陽性葡萄球菌（包括金黃色葡萄球菌和其他凝固酶陽性菌種）的水平計數。該方法采用兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基（RabbitPlasmaFibrinogenAgar,RPFA），通過特定的培養條件和菌落特征識別實現對目標菌的計數。該標準作為水平方法（horizontalmethod），其設計原則是盡可能適用于各類食品基質，包括但不限于肉及肉制品、乳及乳制品、水產品、即食食品、嬰幼兒食品等。2.2方法原理ISO6888-2所規定的檢測方法基于以下核心原理：將適當稀釋度的樣品懸浮液接種于兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基表面，在35~37℃條件下需氧培養24~48小時。凝固酶陽性葡萄球菌在該培養基上生長時，其產生的凝固酶可使培養基中的兔血漿纖維蛋白原轉化為不溶性纖維蛋白，從而在菌落周圍形成特征性的不透明暈圈（opacityzone）。檢測人員依據典型菌落形態（黑色或灰黑色菌落周圍環繞不透明沉淀環）進行計數，必要時通過凝固酶試驗等確認試驗對可疑菌落進行驗證。2.3修改1（Amendment1）的主要修訂內容ISO6888-2:2021/Amd1:2023修改單對原標準進行了技術性修訂，主要涉及以下幾個關鍵方面：（1）培養基成分和制備方法的優化。修改單對兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基中某些組分的含量范圍進行了調整，旨在提高培養基的選擇性和靈敏度。同時，對培養基的配制步驟和滅菌條件提供了更為明確的操作指引，以減少不同實驗室之間在該環節產生的差異。（2）接種和培養條件的細化。修改單對樣品接種量、接種方式（傾注法或表面涂布法）以及培養溫度、時間和濕度條件進行了進一步明確和優化，以增強方法對不同食品基質的適用性和結果的重復性。（3）菌落計數規則的完善。修改單對可疑菌落的確認和計數規則提供了更為清晰的表述，特別是在處理典型菌落與非典型菌落共存、菌落過度生長或融合等情況時，給出了更具操作性的指導原則。（4）精密度數據的更新。修改單補充和更新了基于國際實驗室間協同試驗獲得的精密度數據（重復性限和再現性限），使標準使用者能夠更準確地評估本實驗室檢測結果的可靠性和可比性。（5）編輯性和規范性修訂。修改單對標準文本中的若干術語定義、引用文獻和附錄內容進行了編輯性修訂，以確保標準內容的準確性和與其他相關標準（如ISO6888-1、ISO7218等）的一致性。2.4標準的地位和作用ISO6888-2在國際食品微生物檢測標準體系中具有舉足輕重的地位。該標準與ISO6888-1（采用Baird-Parker瓊脂培養基的計數方法）共同構成了凝固酶陽性葡萄球菌計數的兩大平行方法，使用者可根據實驗室條件和樣品特性選擇適宜的方法。作為國際食品微生物規格標準（如ICMSF的微生物標準）中相關限量的配套檢測方法，ISO6888-2在食品安全國際貿易中發揮著基礎性技術支撐作用。3標準修訂的國內外背景3.1國際食品微生物檢測技術的發展趨勢近年來，食品微生物檢測技術呈現出快速發展的態勢，主要體現在以下幾個方面：分子生物學方法（如實時熒光定量PCR、等溫核酸擴增技術等）在快速篩查領域日益普及；自動化檢測系統和生物傳感器技術不斷推陳出新；培養法作為經典的確證方法，其標準化和精細化程度持續提升。在此背景下，傳統培養計數方法在保持其“金標準”地位的同時，也面臨著持續優化和完善的內在需求。ISO/TC34/SC9作為國際食品微生物檢測標準制定的核心機構，長期致力于推動檢測方法的國際標準化和協調一致。其制定的標準體系涵蓋了食品微生物檢測的各個層面，包括水平方法標準、特定基質方法標準、分子生物學檢測標準以及實驗室質量控制標準等。本修改單的出臺，正是該技術委員會持續開展標準維護和更新工作的成果之一。3.2我國食品微生物檢測標準體系的對接需求我國高度重視食品安全標準化工作。目前，我國已建立了以GB4789系列標準為核心的食品微生物學檢驗標準體系。在凝固酶陽性葡萄球菌計數方面，我國現行有效的國家標準為GB4789.10-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》，該標準等效采用了ISO6888系列標準的技術內容，規定了金黃色葡萄球菌的定性檢驗和定量計數方法，其中定量計數方法包括Baird-Parker平板計數法和兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基計數法。隨著ISO6888-2:2021/Amd1:2023修改單的發布，我國相關標準化技術機構需要及時跟蹤國際標準的最新動態，評估修訂內容對我國現行標準的影響，適時開展國家標準的修訂或補充工作，以確保我國食品微生物檢測方法標準與國際標準保持同步和協調。3.3食品行業和相關方的實際需求4主要修訂內容詳析4.1培養基性能要求的強化兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養基是本方法的核心要素之一，其質量直接決定了檢測結果的準確性。修改單在培養基方面主要從以下三個方面進行了強化：其一，明確了兔血漿纖維蛋白原的質量驗收標準。由于兔血漿的來源、抗凝處理方式、纖維蛋白原含量等因素均可影響培養基的選擇性和靈敏度，修改單對驗收試驗的具體操作和判定標準進行了補充說明，要求每批新配制的培養基均需使用參考菌株進行性能驗證。其二，優化了培養基中補充劑（如磺胺嘧啶鉀、多粘菌素B等選擇性抑菌成分）的添加量和添加方式。通過合理的配方調整，在不影響目標菌回收率的前提下，提高了培養基對背景菌群的抑制效果。其三，補充了培養基配制和保存過程中的注意事項，包括配制用水的水質要求、加熱溶解的溫度和時間控制、培養基的冷卻方式和保存期限等。這些細節性規定有助于減少因操作不當導致的培養基質量波動。4.2操作流程的精細化調整在樣品處理和接種環節，修改單提供了一系列更為明確和可操作的技術指引。具體而言，在樣品均質方面，明確了均質時間和速度的推薦范圍，以確保樣品中目標菌的有效釋放；在稀釋液選擇方面，根據樣品類型的不同，規范了緩沖蛋白胨水（BPW）、0.1%蛋白胨水等稀釋液的使用原則；在接種量方面，明確了每一稀釋度接種到兩塊平板的體積分配方式。與此同時，修改單充分關注了食品基質多樣性對檢測方法適用性的影響。考慮到不同食品基質（如高鹽食品、高脂食品、低水分活度食品等）中凝固酶陽性葡萄球菌的生理狀態可能不同，修改單在培養條件方面提供了適度的靈活性，允許實驗室在一定范圍內調整培養條件，但需進行相應的方法驗證，并將驗證記錄納入質量管理體系文件。這一安排既保證了方法的標準化水平，又兼顧了實際檢測工作的靈活性需求。4.3結果報告方式的明確在結果計算和報告方面，修改單對菌落計數的有效數字修約規則、不同稀釋度計數結果的加權計算方式、以及低于檢測限（如<10CFU/g）和高于計數上限時的結果報告方式等，均提供了更為明確的技術指引。這些規定有助于減少不同實驗室在結果表達環節的差異，提高檢測數據的規范性和可比性。4.4質量控制要求的提升修改單進一步強化了實驗室內部質量控制的有關要求。除了常規的空白對照、陽性對照和陰性對照外，修改單鼓勵實驗室在每批樣品檢測時同步開展加標回收試驗（spikerecoverytest），以持續監測和評估方法在本實驗室條件下的回收率和檢測效能。同時，修改單呼應了ISO7218（食品和動物飼料微生物檢驗的一般要求和指南）中的有關質量控制原則，強調了培養基質量驗證、設備校準和人員能力確認等在保障檢測結果可靠性方面的重要性。5標準修訂的預期影響5.1對檢測準確性和可比性的改善通過上述技術修訂，ISO6888-2:2021/Amd1:2023有望在多個維度上改善凝固酶陽性葡萄球菌計數檢測的性能表現。首先，培養基配方的優化和驗收標準的明確，將直接提高目標菌的回收率和選擇性，減少假陰性和假陽性結果的發生概率。其次，操作流程的精細化調整有助于減少不同操作人員和不同實驗室之間的操作變異性，從而提高檢測結果的重復性和再現性。最后，精密度數據的更新為標準使用者提供了更為準確的測量不確定度評估依據，有助于更科學地解讀和比較檢測結果。5.2對國際貿易和技術協調的促進食品國際貿易對檢測方法的國際互認提出了很高的要求。ISO標準作為國際通行的技術規則，其不同版本之間如果存在較大的技術差異，可能給國際貿易中的檢驗互認帶來障礙。本修改單的發布實施，為各成員國提供了一個更新、更完善的技術參照，有助于各國在檢測方法和結果判定方面保持協調一致，減少技術性貿易壁壘。5.3對我國標準體系建設的啟示我國食品微生物學檢驗標準體系雖然已形成了較為完整的架構，但在標準更新速度、精密度數據積累、方法適用性驗證等方面仍存在一定的提升空間。ISO6888-2修改單的發布，給我國標準化工作提供了有益的啟示：一是需加強國際標準跟蹤和評估機制建設，及時識別和評估國際標準修訂對我國標準體系和檢測實踐的影響；二是需重視實驗室間協同試驗數據的系統積累，為標準修訂提供充分的技術數據支撐；三是需關注新興檢測技術與傳統培養方法的協同應用，推動標準體系的持續優化和升級。6主要參與單位和機構6.1國際標準化組織食品技術委員會（ISO/TC34）ISO/TC34是國際標準化組織下設的負責食品領域標準制定的技術委員會，成立于1947年，秘書處目前由法國標準化協會（AFNOR）承擔。該委員會的工作范圍涵蓋農產食品的術語、取樣、檢驗和分析方法、產品質量規格、包裝和儲存要求等廣泛領域，其制定的標準在全球食品貿易和食品安全監管中發揮著基礎性作用。ISO/TC34的組織架構中，與食品微生物學檢測相關的技術工作主要由其第9分技術委員會（SC9）——“食品微生物學”分技術委員會承擔。SC9負責制定和修訂食品和動物飼料微生物檢驗領域的水平方法標準、專用方法標準和相關指南文件，其工作成果構成了國際食品微生物檢測標準體系的核心內容。SC9的主席和秘書處分別由荷蘭和法國的專家和標準化機構承擔，委員來自世界各國的標準化機構、科研院校、檢測機構和行業組織。在ISO6888-2:2021/Amd1:2023的修訂工作中，SC9專門成立了工作組（WG），匯集了來自多個成員體的微生物學專家和標準化專家。工作組在充分收集各成員體使用反饋和實驗室間協同試驗數據的基礎上，經過多輪討論和磋商，最終達成了修改單的技術內容共識。該修改單的形成，充分體現了ISO標準制定過程中科學性和協商一致性的基本原則。6.2國際食品微生物規格委員會（ICMSF）國際食品微生物規格委員會（InternationalCommissiononMicrobiologicalSpecificationsforFoods,ICMSF）作為聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）聯合設立的國際食品微生物標準咨詢機構，長期致力于食品微生物風險評估和微生物標準制定。雖然ICMSF不直接參與ISO標準的制定，但其出版的微生物標準指南和食品微生物生態學系列著作，為包括ISO6888-2在內的諸多國際標準提供了重要的科學基礎。ICMSF在其第2版《食品微生物學——檢測與規格的公共衛生意義》（Microorg