GB 5009.270-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中肌醇的測(cè)定.pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) G B5 0 0 9.2 7 02 0 1 6 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中肌醇的測(cè)定 2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì) 國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局 發(fā) 布 G B5 0 0 9.2 7 02 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B5 4 1 3.2 52 0 1 0 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測(cè)定 。 本標(biāo)準(zhǔn)與G B5 4 1 3. 2 52 0 1 0相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中肌醇的測(cè)定” ; 增加了食品的檢出限和定量限; 修改了方法的適用范圍; 修改了試樣制備和樣品前處理方法; 修改了精密度。 G B5 0 0 9.2 7 02 0 1 6 1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中肌醇的測(cè)定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中肌醇的測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中肌醇的測(cè)定, 本標(biāo)準(zhǔn)第二法適用于調(diào)制乳品、 飲料中肌醇的測(cè)定。 第一法 微生物法 2 原理 利用葡萄汁酵母菌( S a c c h a r o m y c e su v a r u m) 對(duì)肌醇的特異性和靈敏性, 定量測(cè)定試樣中待測(cè)物質(zhì) 的含量。在含有除待測(cè)物質(zhì)以外所有營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中, 微生物的生長(zhǎng)與待測(cè)物質(zhì)含量呈線性關(guān)系, 根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較, 即可計(jì)算出試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量。 3 試劑和材料 除非另有說(shuō)明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的二級(jí)水。 3.1 試劑 3.1.1 氯化鈉(N a C l) 。 3.1.2 氫氧化鈉(N a OH) 。 3.1.3 鹽酸(HC l) 。 3.1.4 五氧化二磷(P2O5) 。 3.1.5 葡萄汁酵母菌(S a c c h a r o m y c e su v a r u m) ,AT C C9 0 8 0, 或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。 3.2 試劑配制 3.2.1 氯化鈉溶液(9g/L) : 稱取9.0g氯化鈉溶解于10 0 0m L水中, 分裝試管, 每管1 0m L。1 2 1滅 菌1 5m i n。 3.2.2 鹽酸溶液(1m o l /L) : 量取8 2m L鹽酸, 冷卻后定容至10 0 0m L。 3.2.3 鹽酸溶液(0.4 4m o l /L) : 量取3 6. 6m L鹽酸, 冷卻后定容至10 0 0m L。 3.2.4 氫氧化鈉溶液(6 0 0g/L) : 稱取3 0 0g氫氧化鈉溶解于水中, 冷卻后定容至5 0 0m L。 3.2.5 氫氧化鈉溶液(1m o l /L) : 稱取4 0g氫氧化鈉溶解于水中, 冷卻后定容至10 0 0m L。 3.3 標(biāo)準(zhǔn)品 肌醇標(biāo)準(zhǔn)品( C6H1 2O6) : 純度9 9%, 或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。 G B5 0 0 9.2 7 02 0 1 6 2 3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 3.4.1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.2m g/m L) : 肌醇標(biāo)準(zhǔn)品置于五氧化二磷的干燥器中干燥2 4h以上, 稱取 5 0m g肌醇標(biāo)準(zhǔn)品( 精確到0. 1m g) , 用水充分溶解, 定容至2 5 0m L棕色容量瓶中, 貯存在4冰箱中。 3.4.2 肌醇標(biāo)準(zhǔn)中間液(1 0g/m L) : 吸取5.0 0m L肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, 用水定容到1 0 0m L棕色容量瓶 中, 貯存在4冰箱中。 3.4.3 肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液(1g/m L和2g/m L) : 吸取1 0m L肌醇標(biāo)準(zhǔn)中間液兩次, 分別用水定容到 1 0 0m L容量瓶和5 0m L容量瓶中。該工作液需每次臨用前配制。 3.5 材料 3.5.1 培養(yǎng)基 3.5.1.1 麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基(M a l tE x t r a c tA g a r) : 可按附錄A配制。 3.5.1.2 肌醇測(cè)定培養(yǎng)基: 可按附錄A配制。 注:一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好, 商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行配制。 3.5.2 玻璃珠 直徑約5mm。 4 儀器和設(shè)備 注:除微生物常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外, 其他設(shè)備和材料如下: 4.1 天平: 感量為0.1m g。 4.2 p H計(jì): 精度0.0 1。 4.3 分光光度計(jì)。 4.4 渦旋振蕩器。 4.5 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速20 0 0r/m i n。 4.6 恒溫培養(yǎng)箱:3 01。 4.7 振蕩培養(yǎng)箱:3 01, 振蕩速度1 4 0次/m i n 1 6 0次/m i n。 4.8 壓力蒸汽消毒器:1 2 1(0.1 0MP a 0.1 2MP a) 。 注:玻璃儀器使用前, 用活性劑( 月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可) 對(duì)硬玻璃測(cè)定管及其他必要的 玻璃器皿進(jìn)行清洗, 清洗之后2 0 0干熱2h。 5 分析步驟 5.1 接種菌懸液的制備 5.1.1 菌種復(fù)蘇 將菌株活化后接種到麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上, 3 01培養(yǎng)1 6h2 4h后, 再轉(zhuǎn)接2代3 代來(lái)增強(qiáng)活力, 制成貯備菌種, 貯于4冰箱中, 保存期不要超過(guò)2周。臨用前接種到新的麥芽浸粉瓊 脂斜面培養(yǎng)基上。 5.1.2 接種菌懸液的制備 在使用的前一天將貯備菌種轉(zhuǎn)接到新配制的麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上, 于3 0 1 培養(yǎng) G B5 0 0 9.2 7 02 0 1 6 3 2 0h2 4h。用接種環(huán)刮取菌苔到裝有氯化鈉溶液(9g/L) 的試管中。以20 0 0r/m i n離心1 5m i n, 如 此清洗3次4次。吸取一定量的該菌液移入裝有1 0m L氯化鈉溶液(9g/L) 的試管中, 制成接種菌 懸液。 用分光光度計(jì), 以氯化鈉溶液作空白, 5 5 0n m波長(zhǎng)下測(cè)定該接種菌懸液的透光率, 調(diào)整加入的菌液 量或者加入一定量的氯化鈉溶液使該菌懸液透光率在6 0%8 0%。 5.2 試樣制備 谷物類、 乳粉等試樣需粉碎、 研磨、 過(guò)篩( 篩板孔徑0. 3mm0.5mm) ; 肉及肉制品等用打碎機(jī)制成 食糜; 果蔬等試樣需勻漿混勻; 液體試樣用前振搖混合。4冰箱保存, 1周內(nèi)測(cè)定。 5.3 試樣提取 準(zhǔn)確稱取肌醇0. 5m g 2.0m g的試樣, 一般乳粉、 新鮮果蔬、 內(nèi)臟、 生肉試樣1g( 精確至0.0 1g) ; 谷類、 豆類、 含量較低的天然食品試樣5g( 精確至0. 0 1g) , 一般營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑、 復(fù)合營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑0. 1g 0.5g; 液體飲料或流質(zhì)、 半流質(zhì)試樣5g 1 0g于2 5 0m L錐形瓶中, 對(duì)于干粉試樣加入8 0m L鹽酸溶 液( 0.4 4m o l /L) , 對(duì)于液體試樣加入1 0 0m L鹽酸溶液( 0.4 4m o l /L) , 混勻。 將錐形瓶以鋁箔紙覆蓋, 在滅菌釜中1 2 5水解1h。取出, 冷卻至室溫, 加入約2m L氫氧化鈉溶 液( 6 0 0g /L) , 冷卻。用氫氧化鈉溶液( 1m o l /L) 或鹽酸溶液( 1m o l /L) 調(diào) p H 至5. 2, 轉(zhuǎn)入2 5 0m L容量 瓶中, 定容至刻度。混勻, 過(guò)濾, 收集濾液, 該濾液為待測(cè)液。調(diào)整稀釋度, 使待測(cè)液肌醇的濃度在1 g /m L1 0g/m L范圍內(nèi)。 5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按表1順序加入水、 肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液和肌醇測(cè)定培養(yǎng)基于培養(yǎng)管中, 一式三份。 表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 試管號(hào) S 1S 2S 3S 4S 5S 6S 7S 8S 9S 1 0 水/m L 5543210210 肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液( 1g/m L) /m L0012345000 肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液( 2g/m L) /m L0000000345 培養(yǎng)基/m L 5555555555 5.5 待測(cè)液的制作 按表2加入水、 待測(cè)液和肌醇測(cè)定培養(yǎng)基于培養(yǎng)管中, 一式三份。 表2 待測(cè)液的制作 試管號(hào) 1234 水/m L 4321 試樣提取液/m L 1234 培養(yǎng)基/m L 5555 5.6 滅菌 每支試管內(nèi)加入一粒玻璃珠, 蓋上試管帽, 1 2 1滅菌5m i n( 商品培養(yǎng)基按標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行滅菌) 。 G B5 0 0 9.2 7 02 0 1 6 4 5.7 接種 將試管固定在振蕩培養(yǎng)箱內(nèi), 用約1 4 0次/m i n1 6 0次/m i n的振蕩速度, 在3 01振蕩培養(yǎng) 2 2h2 4h。 5.8 測(cè)定 注:對(duì)每支試管進(jìn)行視覺(jué)檢查, 接種空白試管S 1內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的, 如果出現(xiàn)渾濁, 則結(jié)果無(wú)效。 5.8.1 從振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)取出試管, 放入滅菌釜內(nèi),1 0 0保持5m i n, 使微生物停止生長(zhǎng)。 5.8.2 用接種空白試管S 1作空白, 將分光光度計(jì)透光率調(diào)到1 0 0%( 或吸光度為0) , 讀出接種空白試管 S 2的讀數(shù)。再以接種空白試管S 2作空白, 調(diào)節(jié)透光率為1 0 0%( 或吸光度為0) , 依次讀出其他每支試 管的透光率( 或吸光度) 。 5.8.3 用渦旋振蕩器充分混合每一只試管( 也可以加一滴消泡劑) 后, 立即將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)進(jìn)行 測(cè)定, 波長(zhǎng)為5 4 0n m6 6 0n m, 待讀數(shù)穩(wěn)定3 0s后, 讀出透光率, 每支試管穩(wěn)定時(shí)間要相同。以肌醇標(biāo) 準(zhǔn)系列的濃度為橫坐標(biāo), 透光率為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.8.4 根據(jù)待測(cè)液的透光率, 由標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到該待測(cè)液中肌醇的濃度, 再根據(jù)稀釋因子和稱樣量計(jì) 算出試樣中肌醇的含量。透光率超出標(biāo)準(zhǔn)曲線管S 3S 1 0范圍的試樣管要舍去。 5.8.5 對(duì)每個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的試管, 用每支試管的透光率計(jì)算每毫升該編號(hào)待測(cè)液肌醇的濃度, 并計(jì) 算該編號(hào)待測(cè)液的肌醇濃度平均值, 每支試管測(cè)得的濃度不超過(guò)其平均值的1 5%, 超過(guò)者要舍去。如 果有1管的測(cè)定結(jié)果不符合上述要求, 則舍棄該管的測(cè)定結(jié)果, 重新計(jì)算平均值; 如果有2管的測(cè)定結(jié) 果不符合上述要求, 則需重新檢驗(yàn)。 注:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 既可讀取透光率, 也可讀取吸光度。 6 分析結(jié)果表述 試樣中肌醇的含量按式( 1) 計(jì)算: X=C x m f 10 0 01 0 0 (1) 式中: X 試樣中肌醇的含量, 單位為毫克每百克( m g /1 0 0g) ; Cx 5. 8.5中計(jì)算所得的平均值, 單位為微克( g) ; m 樣品質(zhì)量, 單位為克( g) ; f 樣液稀釋倍數(shù); 10 0 0 換算系數(shù); 1 0 0 換算系數(shù)。 計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 7 精密度 天然食品: 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的1 5%。 強(qiáng)化食品: 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的8%。 8 其他 天然食品, 稱樣量為5g時(shí), 本方法的檢出限為2. 5m g /1 0 0g, 定量限為5m g/1 0 0g; 強(qiáng)化食品, 稱 樣量為1g時(shí), 本方法的檢出限為1 2. 5m g /1 0 0g, 定量限為2 5m g/1 0 0g。 G B5 0 0 9.2 7 02 0 1 6 5 第二法 氣相色譜法 9 原理 試樣中的肌醇用水和乙醇提取后, 與硅烷化試劑衍生, 正己烷提取, 經(jīng)氣相色譜分離, 外標(biāo)法定量。 1 0 試劑和材料 除非另有說(shuō)明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級(jí)水。 1 0.1 試劑 1 0.1.1 無(wú)水乙醇(C2H6O) 。 1 0.1.2 正己烷(C6H1 4) 。 1 0.1.3 9 5%乙醇(C2H6O) 。 1 0.1.4 三甲基氯硅烷(C3H9C l S i) 。 1 0.1.5 六甲基二硅胺烷(C6H1 9N S i2) 。 1 0.1.6 N,N-二甲基甲酰胺(C3H7NO) 。 1 0.2 試劑配制 硅烷化試劑: 分別吸取體積比為12的三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷, 超聲混勻。現(xiàn)用現(xiàn)配。 注:N, N-二甲基甲酰胺、 三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷必須保證當(dāng)三者混合后無(wú)白色渾濁現(xiàn)象時(shí)方可使用。 1 0.3 標(biāo)準(zhǔn)品 1 0.3.1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)品(C6H1 2O6,C A S號(hào):8 7 - 8 9 - 8) : 純度9 9%, 或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)。 1 0.3.2 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.0 1 0m g/m L) : 稱取1 0 0m g( 精確到0.1m g) 經(jīng)過(guò)1 0 51烘干2h的肌醇 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于1 0 0m L容量瓶中, 用2 5m L水溶解完全。用9 5%的乙醇定容至刻度, 混勻。取1m L此溶 液于1 0 0m L容量瓶中, 用7 0%的乙醇定容至刻度, 混勻。 1 1 儀器和設(shè)備 1 1.1 氣相色譜儀: 配氫火焰離子化檢測(cè)器。 1 1.2 分析天平: 感量為0.1m g。 1 1.3 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速50 0 0r/m i n。 1 1.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 1 1.5 超聲波儀。 1 1.6 恒溫?zé)崴〔邸?1 1.7 烘箱。 G B5 0 0 9.2 7 02 0 1 6 6 1 2 分析步驟 1 2.1 試樣處理與衍生 1 2.1.1 試樣處理: 固態(tài)和粉狀試樣研磨混合均勻后稱取 1g( 精確到 0.1m g) , 于5 0m L容量瓶中, 加入 1 2m L 4 0溫水溶解試樣; 液態(tài)試樣直接稱取1 2g( 精確到0.1m g) 于5 0m L容量瓶中。上述試樣超聲 提取1 0m i n, 用9 5%乙醇定容至刻度, 混勻。靜置2 0m i n后, 取1 0m L于1 5m L離心管中, 以不低于 40 0 0r/m i n離心5m i n。取上清液5m L于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮瓶中。 1 2.1.2 干燥與衍生: 向濃縮瓶中加入1 0m L無(wú)水乙醇, 在8 0 5 下旋轉(zhuǎn)濃縮至近干時(shí)再加入 5m L無(wú)水乙醇繼續(xù)濃縮至干燥, 轉(zhuǎn)移濃縮瓶至烘箱中1 0 0 5烘干1h。加入1 0.0m LN,N-二 甲基甲酰胺, 超聲溶解5m i n并轉(zhuǎn)移至2 5m L有螺紋蓋的離心管中, 加入硅烷化試劑3. 0m L并放于 8 05水浴中衍生反應(yīng)7 5m i n。其間每隔2 0m i n取出振蕩一次, 然后取出冷卻至室溫。加入 5m L正己烷, 振蕩混合后靜置分層。取上層液3m L于預(yù)先加少許無(wú)水硫酸鈉的帶螺紋蓋離心管中, 振蕩后以不低于40 0 0r/m i n離心, 此為試樣測(cè)定液。 1 2.2 肌醇標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液的制備 分別吸取0. 0m L、2.0m L、4.0m L、6.0m L、8.0m L、1 0.0m L肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于濃縮瓶中, 按1 2.1.2 步驟操作。 1 2.3 測(cè)定 1 2.3.1 參考色譜條件 參考色譜條件列出如下: a) 色譜柱: 填料為5 0%氰丙基-甲基聚硅氧烷的毛細(xì)管柱, 柱長(zhǎng)6 0 m, 內(nèi)徑0.2 5 mm, 膜厚 0.2 5m; 或同等性能的色譜柱; b) 進(jìn)樣口溫度:2 8 0; c) 檢測(cè)器溫度:3 0 0; d) 分流比:1 01; e) 進(jìn)樣量:1.0L。 程序升溫見(jiàn)表3。 表3 程序升溫 升溫速率 /m i n 目標(biāo)溫度 保持時(shí)間 m i n 初始溫度 1 2 00 1 01 9 05 0 1 02 2 03 1 2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定液注入到氣相色譜儀中( 色譜圖見(jiàn)圖B. 1) , 以測(cè)得的峰面積( 或峰高) 為縱坐 標(biāo), 以肌醇標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液中肌醇的含量( m g ) 為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 G B5 0 0 9.2 7 02 0 1 6 7 1 2.3.3 試樣溶液的測(cè)定 分別將試樣測(cè)定液注入到氣相色譜儀中得到峰面積( 或峰高) , 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得試樣測(cè)定液中肌 醇的含量( m g ) 。 1 3 分析結(jié)果的表述 試樣中肌醇含量按式( 2) 計(jì)算: X=C sfi mi 1 0 0( 2) 式中: X 試樣中肌醇含量, 單位為毫克每百克( m g /1 0 0g) ; Cs 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得試樣測(cè)定液肌醇的含量, 單位為毫克( m g ) ; fi 試樣測(cè)定液所含肌醇換算成試樣中所含肌醇的系數(shù)為1 0; mi 試樣的質(zhì)量, 單位為克( g) ; 1 0 0 換算系數(shù)。 計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后一位。 1 4 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的1 0%。 1 5 其他 固體或粉末樣品檢出限為1. 0m g /1 0 0g, 定量限為3. 0m g /1 0 0g。 液體樣品檢出限為0. 2m g /1 0 0g, 定量限