第四章第一節染菌的防止

第四章

發酵工業的無菌技術思考題1、染菌對發酵有什么危害，哪些原因會引起染菌？染菌以后應采取什么措施？2、簡述好氧發酵時無菌空氣制備的工藝流程與要求。什么是染菌？發酵過程中除了生產菌以外，還有其它菌生長繁殖。一、發酵工業的無菌處理

滅菌（sterilization）是指用物理或化學方法殺滅或去除物料或設備中一切有生命物質的過程。滅菌實質上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細胞發生溶化、消失的現象。消毒（disinfection）是指用化學或物理的方法殺滅或去除病原微生物的過程，它一般只能殺死營養細胞而不能殺滅細菌芽孢。消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。除菌（degerming）是用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。防腐（antisepsis）就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達到防止食品等發生霉腐的措施。如低溫、缺氧、干燥、高滲、添加防腐劑等。消毒與滅菌的區別消毒與滅菌在發酵工業中的應用二、發酵工業污染的防治策略（一）污染的危害（二）污染的防治

（一）污染（染菌）的危害1.染菌的不良后果

（1）使發酵培養基因雜菌的消耗而損失，造成生產能力下降直至倒罐，造成巨大經濟損失（2）由于雜菌的污染，對產物提取和產品質量造成嚴重的影響，如產物收率降低或產品質量下降。（3）雜菌的代謝改變原反應體系的PH，使發酵發生異常變化，（4）雜菌分解產物，使生產失敗。（5）細菌發生噬菌體感染，細菌細胞被裂解，導致整個發酵生產的失敗。2、染菌危害的具體分析

（1）染菌對不同菌種發酵的影響A．細菌谷氨酸：發酵周期短，培養基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大。肌苷：缺陷型生產菌，培養基豐富，易染菌，營養成分迅速被消耗，嚴重抑制菌生長和合成代謝產物。B.霉菌PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞，發酵一無所獲。檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。C.酵母菌:易污染細菌以及野生酵母菌

D.疫苗：無論污染的是活菌、死菌或內外毒素，都應全部廢棄。（1）染菌對不同菌種發酵的影響（2）染菌種類對發酵的影響青霉素：怕染細短產氣桿菌鏈霉素：怕染細短桿菌、假單孢桿菌和產氣桿菌四環素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌檸檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續污染污染噬菌體噬菌體的感染力強，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發酵產量大幅度下降，嚴重的造成斷種，被迫停產。

污染其它雜菌有些雜菌會使生產菌自溶產生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發酵過程的通氣攪拌。有的雜菌會使發酵液發臭、發酸，致使pH下降，使不耐酸的產品破壞。芽孢桿菌耐熱，不易殺死。

由于接種量較小，生產菌生長一開始不占優勢，而且培養基營養豐富，容易污染雜菌。種子染菌對發酵危害極大，應嚴格控制種子染菌，如在此階段染菌，應將培養液全部廢棄。（3）、不同發酵時期染菌對發酵的影響種子擴大培養期染菌發酵前期染菌發酵前期最易染菌。原因：發酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優勢；且還未合成產物（抗生素）或產生很少，抵御雜菌能力弱。在這個時期要特別警惕以防止染菌的發生。措施：可以用降低培養溫度，調整補料量，用酸堿調pH值，縮短培養周期等措施予以補救。如果前期染菌，且培養基養料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養，重新接種再用。發酵中期染菌，處理困難，危害很大。處理方法應根據各種發酵的特點和具體情況來決定。

發酵中期染菌

原因：發酵中期染菌會嚴重干擾產生菌的代謝。雜菌大量產酸，培養液pH下降；糖、氮消耗快，發酵液發粘，菌絲自溶，產物分泌減少或停止，有時甚至會使已產生的產物分解。有時也會使發酵液發臭，產生大量泡沫。措施：降溫培養，減少補料，密切注意代謝變化情況。如果發酵單位到達一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產中可以將高單位的發酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。發酵后期染菌發酵后期發酵液內已積累大量的產物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產影響不大。如果染菌嚴重，又破壞性較大，可以提前放罐。（4）、雜菌污染對發酵產物提取和產品質量的影響1）發酵染菌對過濾的影響染菌的發酵液一般發粘，菌體大多數自溶，所以在發酵液過濾時不能或很難形成濾餅，導致過濾困難。污染雜菌的種類對過濾的影響程度有差異如污染霉菌時，影響較小，而污染細菌時很難過濾。由于過濾困難，過濾時間拉長，影響發酵液儲罐和過濾設備的周轉使用，破壞了生產平衡。染菌發酵液還會因過濾困難而大幅度降低過濾收率，直接影響提取總收率。2）發酵染菌對提取的影響染菌發酵液中含有比正常發酵液更多的水溶性蛋白和其它雜質。如果采用有機溶劑萃取的提煉工藝，則極易發生乳化，很難使水相和溶劑相分離，影響進一步提純。如果采用直接用離子交換樹脂的提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹脂表面，或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換容量，而且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時與產物一起進入洗脫液，影響進一步提純。如果絲狀菌發酵被產酸菌污染：則pH不斷下降，菌絲大量自溶，發酵液粘度增加，過濾困難。處理方法：①將發酵液加熱后再加助濾劑；②先加絮凝劑使蛋白質凝聚后沉淀。雜菌分泌較多蛋白質雜質時，對發酵后處理過程中采用溶媒萃取的提取工藝非常不利，使水相和溶媒之間極易發生乳化（二）雜菌污染的防治

1.染菌的檢查與判斷染菌的檢查方法：顯微鏡檢查法鏡檢出雜菌需要一定時間平板劃線培養或斜面培養檢查法：菌落噬菌體檢查可采用雙層平板法：噬菌斑肉湯培養檢查法

發酵過程的異常現象判斷：溶解氧、pH、尾氣中的CO2含量、發酵液黏度、顏色等的異常變化，都可能是發生染菌的重要信息。溶解氧水平的異常變化污染好氧性雜菌，溶解氧在短時間內下降，并接近零值，長時間不能回升；污染非好氧性雜菌，生產菌受到抑制，耗氧量減少，溶解氧升高。pH異常變化對于污染產酸菌或利用碳源效率高生長較快的雜菌，會使pH迅速下降。12尾氣中CO2含量異常污染雜菌，糖耗加快，CO2含量增加；感染噬菌體，糖耗減慢，CO2含量減少。2、污染原因分析

主要原因：

①

種子帶菌②無菌空氣帶菌③設備滲漏④滅菌不徹底

⑤操作失誤⑥技術管理不善

染菌原因染菌百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌9.64接種時罐壓跌零0.19培養基滅菌不透0.79總空氣系統有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設備滲漏10.13操作原因10.15

原因不明24.94日本工業技術院發酵研究所多年來抗生素發酵染菌原因分析上海第三制藥廠染菌原因分析

染菌原因染菌百分率%種子帶菌14.15盤管穿孔14.20閥門滲漏23.30空氣系統有菌10.0管理不善25.80其它7.49原因不明5.78

管理不善而染菌，經分析有下表所列原因：染菌原因染菌百分率%進罐前未做設備嚴密度檢查25.8接種違反操作規程25.8檢修質量缺乏驗收制度19.35操作不熟練19.35配料違反工藝規程6.45調度不當3.25（1）從污染雜菌的種類進行分析耐熱芽孢桿菌：滅菌不徹底；球菌或無芽孢桿菌：種子染菌、設備滲漏、無菌空氣帶菌、操作失誤；淺綠色雜菌：冷水管滲漏；霉菌：滅菌不徹底或操作問題；酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時間較長

發酵前期染菌種子帶菌、培養基滅菌和設備滅菌不徹底、設備或管道有死角。發酵中后期染菌補料的料液滅菌不徹底或補料管道、閥門滲漏，操作不合理，一般不會是種子問題。（2）從污染雜菌的時間進行分析（3）從染菌的程度進行分析數個發酵罐感染相同雜菌：空氣系統；個別罐連續感染雜菌：設備問題；單罐染菌不是系統問題，而是該罐本身的問題。如種子帶菌、培養基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效。個別發酵罐連續染菌：設備問題(如閥門的滲漏或罐體腐蝕磨損)，設備的腐蝕磨損所引起的染菌會出現每批發酵的染菌時間向前推移的現象。個別發酵罐偶然染菌：原因比較復雜，因為各種染菌途徑都可能引起。

多罐染菌系統問題，如空氣過濾系統有問題，特別是總過濾器長期沒有檢查，可能受潮失效；移種或補料的分配站有滲漏或滅菌不徹底等。

如果發酵罐偶而染菌，原因一時找不出時一般可以采取以下措施：(1)連續滅菌系統前的料液貯罐在每年4一10月份(雜菌較旺盛生長的時間)加入0.2%甲醛，加熱至80°C，存放處理4小時。(2)對染菌的罐，在培養液滅菌前先加甲醛進行空消處理。甲醛用量每立方米罐的體積0.12－0.17升。(3)對染菌的種子罐可在罐內放水進行滅菌，滅菌后水量占罐體的三分之二以上。這是因為細菌芽孢較耐干熱而不耐濕熱的緣故。3、雜菌污染的途徑及其預防（1）種子帶菌及其防治

種子帶菌的原因：滅菌不徹底(如假壓)；移種污染；培養或保藏過程中污染；無菌室管理不善；

防止種子帶菌措施：制備種子時對沙土管及搖瓶嚴格加以控制。沙土制備時要多次間歇滅菌注意接種時的無菌操作子瓶、母瓶的移種和培養無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內要供給恒溫恒濕的無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學藥品滅菌。無菌室結構要求無菌室面積不宜過大，一般約4—6米2，高約2．6米。為了減少外界空氣的侵入，無菌室要有1—3個套間(緩沖過道)無菌室內部的墻壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求無裂縫，墻角最好做成圓弧形。室內布置應盡量簡單，最好能安裝空氣調節裝置，通入無菌空氣并調節室內的溫濕度。無菌室的每個套間一般都用紫外線滅菌。無菌室接種要求打開紫外燈，照半小時，關燈后15分鐘再接種。消毒藥水擦桌子、拖地，開啟超凈臺的通風，接種時必須在超凈臺上操作，保證無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。（2）過濾空氣帶菌及其防治無菌空氣引起染菌的原因：流程或設備設計的合理性；過慮介質選用、裝填；過慮介質的滅菌和管理；空氣除菌系統復雜，環節多，偶遇不慎便會導致空氣除菌失敗。空氣冷卻器的列管穿孔泄露，冷卻水會滲入到空氣中，造成染菌。棉花-活性炭過濾器長期使用后變薄的一邊失效。過濾介質受潮失效：過濾器滅菌完畢應立即緩慢通入壓縮空氣，將水分吹干。超細纖維紙作過濾介質，滅菌時必須將管道中冷凝水放干凈，以免介質受潮失效。

在生產實踐中，空氣管道大多與其它物料管道相接，要裝上止逆閥防止其它物料竄入空氣管道污染過濾器，導致過濾介質失效。（3）設備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治

生產上常把不能徹底滅菌的部位稱為“死角”

發酵罐的“死角”

法蘭、內襯、接口、表頭、罐內部件及其支撐件如攪拌軸拉桿、聯軸器、冷卻盤管、擋板、空氣分布管及其支撐件。口：人孔（或手孔）、排風管接口、燈孔、視鏡口、進料管口。/jpkc發酵罐罐底膿皰狀積垢罐底的加強板發酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角”

消除方法：加強清洗并定期鏟除污垢；不銹鋼襯里破裂造成“死角”法蘭的“死角”a—墊圈內徑過小；b—墊圈內徑過大；c—法蘭不平造成的泄漏與“死角”abc滅菌時蒸汽不易通達的“死角”及其消除方法管道安裝不當或配置不合理形成的“死角”安裝放汽邊閥

消滅死角的措施減少擋板和開孔；焊接光滑；法蘭、閥門連接正好；減少殘渣沉積；嚴格清洗和檢查；定期檢修易壞部件化學腐蝕電化學腐蝕磨蝕設備加工不良防止設備滲漏：包括夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設備漏等。防止設備滲漏肉眼可見——冷卻盤管、夾套穿孔、閥門滲漏……肉眼不可見——試漏水壓試漏法集氣桶試漏（4）培養基滅菌不徹底導致染菌及其防治培養基滅菌不徹底原因：原料性狀：假壓——“冷壓”的形成；滅菌時培養基產生泡沫連續滅菌時參數不穩定——時間維持不夠或壓力波動較大；滅菌后期的罐壓驟變——“負壓”；設備死角。防治方法：原料性狀：大顆粒的原料過篩除去。實罐滅菌時要充分排除罐內冷空氣。為什么蒸汽滅菌時會產生大量泡沫呢？培養基和水的傳熱系數比空氣的傳熱系數大，如果滅菌時升溫太快，培養基急劇膨脹，發酵罐內的空氣排出較慢，就會產生大量泡沫，泡沫上升到發酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，