熒光顯微技術

熒光顯微鏡熒光顯微鏡

利用一定波長的激發光對樣品進行激發，產生一定波長的熒光，對樣品結構或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。

四、熒光顯微鏡的基本結構光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素燈

濾光片：隔熱、激發和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭

熒光顯微鏡熒光顯微鏡的基本結構隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。激發濾光片：位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過紫外線可見波長的光域，提供合適的激發光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發光而使發射的熒光透過，保護眼睛。熒光顯微鏡濾光片熒光顯微鏡的基本結構透射光：照明光線從標本下經聚光器透過標本進入物鏡。落射光：照明光線從標本上經垂直照明器落射到標本，經標本反射進入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)熒光顯微鏡光路熒光顯微鏡的基本結構一.熒光顯微鏡的原理某些物質在一定短波長的光(如紫外光)的照射下吸收光能進入激發態，從激發態回到基態時,就能在極短的時間內放射出比照射光波長更長的光(如見光)，這種光就稱為熒光。

熒光顯微鏡利用特殊的照明裝置發出較短波長的激發光，誘發熒光物質發出熒光,通過物鏡作用在樣品上，在有目鏡觀察到肉眼可見的熒光。二.熒光顯微鏡的結構主要結構有機械系統和光學系統兩部分，如圖

1.機械系統：包括底座、鏡身、觀察筒三部分

2.光學系統:包括物鏡、聚光鏡、光源等三.熒光顯微鏡的操作及注意事項1．基本操作步驟

(1)安裝紫外防護罩。

(2)打開高壓汞燈的電源控制箱開關。

(3)插入擋光板，中斷光路。

(4)預熱5—10分鐘。

(5)將載有樣品的載玻片放到載物臺上。

(6)選擇接物鏡(按照先低倍，后高倍順序)。

(7)旋轉分光鏡組件轉盤，選擇所需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光時用；“WU”為觀察藍色熒光時用(如DAPl)；“WB”為觀察綠色熒光時用(如FITC)；“WG"為觀察紅色熒光時用(如TRITC)。

(8)使用阻斷濾片(目前多數阻斷濾片內置于熒光顯微鏡)。

(9)通過粗、細螺旋調整焦距。

(10)打開與顯微鏡連接的計算機，點擊數碼成像系統軟件，采集數碼圖像。2.注意事項

(1)因觀察熒光使用的光源為高壓汞燈，其中發出的光含紫外光，對人眼有損害作用，故必須安裝紫外防護罩。

(2)為延長汞燈壽命，打開汞燈后不可立即關閉，以免水銀蒸發不完全而損壞電極，一般需要等15分鐘后才能關閉。

(3)汞燈熄滅后待完全冷卻才能重新啟動，否則燈內汞蒸氣尚未恢復到液態，內阻極小，再次施加電壓，會引起短路，導致汞燈爆炸。這樣不僅損壞電器，更重要的是汞蒸氣溢出，將導致工作室污染。故關閉汞燈之后，不能馬上再次打開，必須等待至少30分鐘。

(4)高壓汞燈工作時會散發大量的熱量，因此，工作環境溫度不宜太高，必須有良好的散熱條件。

(5)汞燈的使用壽命約200—300小時，在電源控制箱上有時間累計計數器，使用者要記錄累計小時數，達到300小時，需更換新燈泡，否則亮度不夠，影響觀察四.熒光顯微鏡標本制作要求（一）載玻片載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。（二）蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光女可激發標本。（三）標本組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重迭或雜質掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。（五）鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。五.熒光顯微鏡應用技術1.

對細胞結構或組分的定性位、半定量研究免疫熒光技術

用熒光標記的抗體或抗原與樣品(細胞、組織或分離的物質等)中相應的抗原或抗體結合，以適當檢測熒光的技術對其進行分析的方法。將抗原或抗體與熒光染料連接，用于檢測相應特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技術(directimmunofluorescenttechnique)”。用熒光染料標記的第二、第三抗體等檢測相應抗原抗體復合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(indirectimmunofluorescenttechnique)”。由于熒光素所發的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位2.作為生物大分子篩選與鑒定的標記物。綠色熒光蛋白綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡稱GFP，其基因所產生的蛋白質，在藍色波長范圍的光線激發下，會發出綠色螢光在生物學研究中綠色熒光蛋白具有廣泛用途，包括有

1.分子標記

利用綠色熒光的發光機制，可將GFP作為蛋白質標簽(proteintagging)，即利用DNA重組技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察2.藥物篩選

熒光探針分布是利用信號傳導中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯，根據熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細胞內可溶且對細胞毒性較小，因而常用作熒光探針直接法直接熒光抗體染色法示意圖熒光素標記的特異性抗體直接與相應抗原反應。六、熒光抗體染色間接法特異性抗體與相應抗原反應，熒光素標記的抗抗體再與第一抗體結合。

間接熒光抗體染色法示意圖熒光抗體染色雙標記法兩種熒光素分別標記的兩種不同的特異性抗體，與同一標本反應，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。熒光抗體染色

設立實驗對照:陽性對照和陰性對照

區分特異和非特異染色

陽性細胞顯色分布:胞質型、胞核型和膜表面型熒光抗體染色結果判斷熒光抗體染色①自身抗體檢測抗核抗體(均質型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點型)熒光抗體技術的應用②病原體檢測寄生蟲（猴胚腎細胞內弓形蟲）細菌（藤黃微球菌)熒光抗體技術的應用③免疫病理檢測腫瘤（人肝癌細胞）熒光抗體技術的應用七、熒光原位雜交概念：原位雜交技術(Insituhybridization，ISH)是用標記的核酸探針，經放射自顯影或非放射檢測體系，在組織，細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段。原理：利用核酸分子單