戊二胺的生物合成-李治

——生物制藥技術戊二胺的生物合成姓名：李治

戊二胺的簡介和其生理作用及工業應用戊二胺(Diaminopentane)，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亞甲基二胺或尸毒素，是生物胺類(包括腐胺、精胺、亞精胺和尸胺等)中的一種。1885年，德國柏林的醫師布瑞哲在腐敗的尸體中首次發現該胺類，并以此得名尸胺。戊二胺是賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧產生的。

戊二胺在關閉孔蛋白通道和保護大腸桿菌免受氧的毒害方面也起著重要的作用；內源性戊二胺的分泌以及胞內高濃度戊二胺積累可導致外膜滲透性降低，抑制某些抗生素如頭孢霉素類抗生素的作用。在農業上，外源施加戊二胺可以改善坐果和促進果實發育，提高果實的產量；在醫學上，它也可作為一種有效治療痢疾的藥物；在工業上，戊二胺與二元酸進行聚合反應可合成優質高分子材料——新型尼龍。簡述幾種戊二胺的合成方法戊二胺的制備方法主要可以分為兩大類：化學合成法和生物轉化法。化學合成法條件苛刻、污染環境，而生物轉化法過程復雜、成本較高。目前，利用基因工程技術構造代謝工程菌來直接規模化制備人類所需產品是最經濟、最環保和最有前途的方法，是代謝工程研究的方向和熱點。1.實驗室的制備

采用戊二腈為原料，把戊二腈的無水乙醇溶液煮沸之后，快速加入金屬鈉，反應完之后向其中加入水，蒸出乙醇，剩余反應物采用過熱蒸汽蒸餾。蒸出的餾出物用稀鹽酸中和、蒸干，剩余物用冷無水乙醇洗滌，再用少量固體氫氧化鉀和水分解所得的鹽酸鹽，蒸去水，減壓蒸餾，即可得到戊二胺。西北大學李崇等人采用非晶態鎳催化劑在戊二腈上催化加氫來制備戊二胺，取得不錯結果。

2.生物體直接提取法戊二胺是生物體內廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，雖然它在腐爛的尸體和精液中都可以分離得到，但是含量較低，不適合大量的生產，而且也未曾有此方面的報道。3.微生物轉化法

微生物轉化法主要是利用底物賴氨酸在賴氨酸脫羧酶的催化下脫去羧基生成戊二胺。L-賴氨酸脫羧酶存在于E.coli、尸桿菌等大多數微生物中，一些高等植物中也有。日本太卡哈斯等通過游離大腸桿菌L-賴氨酸脫羧酶用D,L-賴氨酸作為底物以不對稱降解L-賴氨酸的方式得戊二胺和D-賴氨酸。該反應步驟多，產物分離過程復雜，成本高，產率低(38%)。日本東麗尖端融合研究所用高效表達大腸桿菌來源的賴氨酸脫梭酶的大腸桿菌高效率生成戊二胺。4.微生物直接生產法

日本東麗尖端融合研究所通過對賴氨酸工業生產上所用的谷氨酸棒桿菌進行轉基因操作，又開發了從葡萄糖生產戊二胺的技術。可以用高絲氨酸脫氫酶基因被破壞的、用來發酵生產賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株為宿主，把來源于大腸桿菌的賴氨酸脫梭酶基因的表達單元插入高絲氨酸脫氫酶基因座。通過玻璃發酵罐的發酵試驗發現，培養15小時可以生產出2.5g/L戊二胺。目前，通過基因工程篩選得到的谷氨酸棒狀桿菌是生產戊二胺的最好菌株。生物法生產戊二胺需要解決的首要問題是提高該菌株對高濃度產物的耐受性。傳統化學催化合成戊二胺法

采用非晶態鎳催化劑、以無水乙醇為溶劑,在高壓反應釜中進行了戊二腈催化加氫制備戊二胺。非晶態鎳催化劑上戊二腈催化加氫制備戊二胺的反應歷程為:首先戊二腈催化加氫生成5一氨基戊腈,然后5一氨基戊腈催化加氫生成目標產物戊二胺和副產物六氫吡啶。經查找文獻其最佳反應條件為：非晶態Fe-Mo一Ni一Al催化劑用量15%、NaoH助催化劑用量0.25%、戊二腈與乙醇的體積比1:5、反應壓力3Mpa、反應溫度70℃的優化反應條件下,戊二睛的轉化率達100%。(Lichong,etal.,2007,petrochemicaltechnology)發酵生產微生物代謝途徑及其發酵酶轉化生產流程目前最常用的微生物是大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌，已經對戊二胺在細菌體內的代謝過程進行了深入研究。以大腸桿菌為例，在大腸桿菌體內，戊二胺是經賴氨酸途徑合成的。賴氨酸由TCA循環產生的草酰乙酸和l分子丙酮酸、2分子氨、4分子NADPH(還原型輔酶II)作用，經過10步反應得到。首先，草酰乙酸經氨基化合成天冬氨酸；然后，天冬氨酸在3種同工酶作用下，通過磷酸化轉化成天冬氨酰磷酸；天冬氨酸磷酸經還原形成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛與丙酮酸再經6步反應生成二氨基庚二酸，最后經脫羧形成產物賴氨酸。

微生物轉化法生產尸胺的過程可分為菌體發酵培養過程（產酶過程）、底物與菌體轉化反應過程和產物尸胺的分離提取精制過程。日本東麗尖端融合研究所用高效表達大腸桿菌來源的賴氨酸脫羧酶高效率生成尸胺。其流程如下：(1)將大腸桿菌中cadA基因進行PCR擴增，然后連入到pUC18中，將質粒轉入宿主菌大腸JM109菌株中，利用卡那霉素篩選出轉化子。(2)將E.coliJM109pcadA菌株在培養基中進行培養，種子液接入的培養基中，在發酵罐中進行培養。經培養，培養物轉入發酵罐中繼續培養，培養之后加入IPTG(溶于水中)誘導，再繼續培養。(3)培養結束后經離心來收集菌體，可得到濕菌體，再將底物和濕菌體加入到反應器中進行轉化反應。并不斷向其中流加己二酸，目的是中和產生的戊二胺，使pH維持在6.0左右，尸胺轉化率可達到98%。(4)反應液離心除去菌體，在上清液中加入活性炭并在20℃下攪拌進行脫色，然后過濾除去活性炭，濾液再減壓濃縮。然后，在4℃冰箱中冷卻析出晶體。離心收集晶體，于減壓干燥器中干燥數天。(5)將所得干燥的晶體經X射線衍射分析，結果發現，晶體是按戊二胺:己二酸摩爾比為1:1的方式而形成的結晶，晶體純度達到99%或更高，可直接進行聚合反應生產尼龍。發酵液中戊二胺的提取和精制

先將發酵液中的細胞組分除去，然后經過四步，即發酵液堿化、熱處理、有機萃取劑萃取、有機相分離戊二胺。堿化發酵液至pH>11，熱處理的目的是使乙酰基-DAP水解，溫度選在90-110℃或在過壓下加熱到更高的溫度進行熱處理。萃取劑選用偶極質子性有機溶劑，如鏈烷醇或環烷醇，萃取過程和隨后的相分離過程在升溫條件下進行。

從工業發酵肉湯中分離純化出戊二胺單體，并獲得較高的產量，可以使用快速萃取的純化方法。從發酵肉湯中分離純化提取戊二胺單體主要包括分離、絮凝、過濾等方法去除細胞；然后，加入氫氧化鈉、氫氧化鈣或氫氧化鉀來調節pH>12；隨后，通過加熱發酵肉湯來水解可能存在的副產物N-乙酰基-二氨基戊烷；再使用在堿性環境下穩定的有機溶劑（如正丁醇）進行萃取，可得到戊二胺的粗產品。利用色譜、蒸餾或酸沉淀法將戊二胺純化，純化