比較蛋白質組學及系統研究方法

比較蛋白質組學及系統研究方法比較蛋白質組學及系統研究方法蛋白質的合成受時空等多種因素調控，在不同的組織細胞中蛋白質合成及表達的種類和數量有很大的差異，即使在細胞發育的不同階段，因不同時期、不同條件，蛋白質組的構成也在不斷的變化，是動態的過程第一部分：基本概念比較蛋白質組學及系統研究方法第一部分：基本概念蛋白質組(Proteome)指由一個基因組，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質。比較蛋白質組學：蛋白質組間差異蛋白的研究。比較蛋白質組學及系統研究方法第一部分：基本概念生物學問題的提出實驗模型的設計實驗組和對照組樣品的制備圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點的切取胰酶對脫色后蛋白質消化質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜結果的生物信息學分析和比對新蛋白質的發現其它實驗的進一步驗證蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離比較蛋白質組學基本技術路線Introduction蛋白質的提取1蛋白質的分離2蛋白質樣品的分析3驗證4第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法比較蛋白質組學及系統研究方法Introduction蛋白質的提取1莢膜層細胞粘液層比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態（包括多數疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現性。防止樣品在聚焦時發生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。樣品的分級處理可降低樣品的復雜性并富集低豐度蛋白質。當前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進行分離。樣品制備對于獲得可靠、準確的2D電泳結果至關重要Introduction比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變溶液中的氫鍵結構使蛋白質充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經過變性劑處理而暴露蛋白質的疏水基團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質展開更完全，溶解更徹底。比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法—水浴加熱處理—TritonX-114相分離法提取膜蛋白—蛋白質沉淀及透析除雜—真空冷凍干燥硫轉運膜蛋白質的有效分離和提取雙向電泳分離膜蛋白比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法雙向電泳具體步驟蛋白預處理（裂解，水化）蛋白質上樣緩沖液的配制：一定量的

蛋白質樣品溶解在緩沖液含7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%NP-40，2%IPG緩沖液，65mmol/LDTT，0.002%溴酚藍IPG條重泡漲及上樣第一向：IEFIPG條平衡平衡緩沖液Ⅰ(還原)平衡緩沖液Ⅱ(巰烷基化)第二向：SDS膠條染色及脫色凝膠成像及圖像分析比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法凝膠的圖像處理分析和差異蛋白質點的挖取及膠內酶切凝膠圖像的掃描圖像加工斑點檢測和定量凝膠配比數據分析數據呈遞和解釋2-DE數據庫的建立差異蛋白質點的挖取膠內酶切ImageMaster2dPlatinum圖像分析軟件可用于膠的圖像分析比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法Introduction比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法差異蛋白質點的挖取及脫色、膠內酶切元素硫基質中膜蛋白2-DE圖譜亞鐵基質中膜蛋白2-DE圖譜選取差異表達的蛋白質點，經過脫色處理后用胰蛋白酶（Trypsin）進行特異性酶切，最后進行質譜分析得到相關肽指紋圖譜比較蛋白質組學及系統研究方法目前雙向電泳需解決的問題樣品的制備及溶解膜蛋白疏水性強初步分離高豐度蛋白、堿性蛋白及大分子量蛋白靈敏度及可重復性第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法N-端測序：得到的是序列。未知蛋白測序。稱為ProteinSequencing。

生物質譜分析

：返回的數據是分子量。可以和已知的蛋白（數據庫）比對，告訴你是什么蛋白。稱為ProteinIdentificationbyMS。比較蛋白質組學主流手段是生物質譜分析

，價格便宜，分析速度快。比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法蛋白質樣品的分析3比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法質譜分析原理進樣系統1.氣體擴散2.直接進樣3.色譜離子源1.電子轟擊2.化學電離3.場致電離4.激光

質量分析器1.單聚焦2.雙聚焦3.飛行時間4.四極桿

檢測器MALDI-TOF一級質譜儀，二級質譜，MALDI-TOF-TOF串聯質譜儀，LC-MS/MS色譜質譜連用比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法A.ferrooxidans胞外蛋白質斑點的肽指紋圖質譜結果比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法軟件名稱MascotSEQUESTX!Tandem軟件類型商業軟件商業軟件免費開源軟件數據格式MGF、DTA、PKLRAW、DTADTA、PKL、MGF、mzXML注：在線檢索均為免費蛋白質質譜檢索常用軟件常用的是Mascot比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法檢索的數據庫，可以知道數據庫大小匹配的結果大于70分即成功鑒定(可靠性達到顯著水平)縱坐標：匹配的蛋白數目陰影線：區分匹配結果可靠與不可靠的分界線橫坐標：匹配的蛋白得分小紅柱：匹配的結果比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法比較蛋白質組學及系統研究方法ProtParam蛋白質序列的物理-化學參數（氨基酸、原子組成，等電點，消光系數等）MultiIdent通過等電點、分子量、氨基酸組成、序列標簽、肽指紋數據等識別蛋白AACompSim蛋白質氨基酸組成與數據庫進行對比分析AACompIdent通過氨基酸組成識別蛋白質

3DProteinDisplayandSequenceAnalysisforthePC(UIUC)蛋白質三維構象展示第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法驗證4比較蛋白質組學及系統研究方法1.蛋白質印跡法（免疫印跡試驗）即WesternBlot?

試劑準備?

樣品制備?

含量測定?

SDS－PAGE電泳?

轉膜?

免疫反應?

化學發光?

凝膠圖象分析第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法比較蛋白質組學及系統研究方法未知樣品的Ct值，從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法2.熒光實時定量PCR（Real-timeqPCR）實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。RT-PCR結果比較蛋白質組學及系統研究方法第二部分：比較蛋白質組學系統研究方法XANES光譜：對提取