實驗重組與細胞轉化年博

實驗重組與細胞轉化年博1第一頁，共三十九頁，2022年，8月28日實驗安排實驗安排實驗一：DNA重組與轉化實驗二：重組DNA提取與鑒定實驗三：基因組DNA制備實驗四：PCR實驗五：SDS實驗六：WesternBlot實驗七八：SouthernBlot課程負責人：潘鑾鳳教師：邵紅霞（秘書）王松梅支秀玲2第二頁，共三十九頁，2022年，8月28日實驗流程圖質粒重組轉化鑒定制備探針實驗一、二SouthernBlot實驗七、八

細胞培養基因組DNA的制備濃度測定

PCR擴增實驗三、四3細胞總蛋白提取濃度測定SDSWesternBlot實驗五、六3第三頁，共三十九頁，2022年，8月28日溫馨提醒女廁在3、5樓西側；男廁在2、4樓西側寄包柜密碼僅一次有效，再次寄存需重新啟動。非貴重物品建議不要寄存，可放置旁邊的架子上走廊左側有飲水機4第四頁，共三十九頁，2022年，8月28日實驗注意事項1.實驗用品分組（3人一組）標記，放于實驗桌上。實驗開始時清點；實驗結束，請各組同學將用品歸于原位，整理好本組桌面后再離開。需要回收的器皿初步沖洗后浸泡在水槽內的盆中（如玻璃耗材等，有疑問請咨詢帶教老師）實驗開始前請勿亂翻動！每組2個盆，1個桶，分別放冰，液體垃圾，固體垃圾，結束時每組自行清理5第五頁，共三十九頁，2022年，8月28日2.實驗試劑：常規試劑通常3人一組放在桌上，部分試劑一大桌放一管需要低溫放置的試劑在講臺，需到講臺來加樣，特別是酶，加完及時放回原位有些常規用試劑（如水，加樣buffer），可室溫保存，多次使用6第六頁，共三十九頁，2022年，8月28日3.離心機的正確使用：（注意安全和儀器保護）

平衡——15ml連同托架一起平衡，1.5ml目測體積，對應位置放置離心機蓋（包括內蓋）

最高速度不能超限離心時，請等到達設定轉速并運轉正常后再離開離心結束如是低溫離心，請先開機將離心機預冷，離心間歇階段關機蓋，離心結束，請打開機蓋晾干7第七頁，共三十九頁，2022年，8月28日4.加樣槍Pipet的正確使用

當加樣槍轉到它的最高體積時，絕對不能再往前轉，不然這把加樣槍就會被損壞，完全不能再用。選用合適量程的加樣器正確進行刻度調節（不能旋過頭）清潔愛護加樣器吸樣品和加樣品時的手勢合理8第八頁，共三十九頁，2022年，8月28日加樣槍的保護：吸取樣品時，加樣槍不要碰到管口或瓶壁吸取酚、氯仿等腐蝕性液體時，要慢吸快放刻度調試和清洗消毒保證吸取樣品量的準確并且不造成試劑浪費

9第九頁，共三十九頁，2022年，8月28日加樣前，先將EP管輕彈幾下混勻，然后再進行短暫離心后才能吸取樣品吸取樣品的時候，為保證吸取量的準確，需盡可能將槍頭深入液體深部吸取粘稠的樣品如DNA時，宜慢慢吸取以保證量的準確，還可用同批槍頭吸取水分以觀察液體在槍頭上的位置以保證吸取量的準確先加體積大的樣品，特別是水，然后再加小體積的樣品或酶等小體積的樣品或酶要加入到液體中，并需輕輕吹打幾次以混勻關于加樣槍使用，以下說法正確嗎？√×√√×10第十頁，共三十九頁，2022年，8月28日5.實驗中請注意化學試劑對人體的傷害。（帶手套）

如酚有腐蝕性；溴化乙啶有致癌之嫌；丙烯酰胺有神經毒性；某些酸堿，尤其濃酸濃堿的腐蝕性；等等。（嚴防手套造成二次污染）6.紫外線會造成眼睛損傷。在紫外檢測儀上觀察電泳條帶時要蓋好有機玻璃板，或戴上防護面罩。7.值日生將按組輪流，負責整理實驗室。值日生負責清理實驗室，倒垃圾，最后離開11第十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日實驗報告撰寫實驗名稱、實驗時間、學生姓名、學號、專業、帶教老師等實驗目的、實驗原理、實驗器材和試劑（可不寫）、實驗步驟（簡單）、實驗結果、實驗注意事項等實驗討論（對實驗過程、結果的討論；自己的體會等）（重點）實驗報告要求每人獨立完成，分四次上交12第十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日儀器及位置介紹恒溫氣浴搖床412室超凈工作臺13第十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日410室制冰機低溫冰箱14第十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日402室PCR儀微孔板分光光度計+Take3?超微量多體積檢測板15第十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日交聯儀雜交爐402室16第十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日水浴鍋實驗室側邊臺脫色搖床17第十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日1.5ml離心機臺式（低溫）離心機實驗室側邊臺微波爐18第十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日電熱恒溫培養箱實驗室側邊臺分光光度計19第十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日15ml離心機臺式（低溫）離心機實驗室后面邊臺20第二十頁，共三十九頁，2022年，8月28日實驗室桌上漩渦振蕩器常溫低速小離心機21第二十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日可調微量加樣器和加樣頭實驗室桌上22第二十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日接種環推棒實驗室桌上23第二十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日長玻璃試管刻度吸管滴管實驗室桌上離心管24第二十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日一、實驗目的1．CaCl2法制備感受態細胞（E.coliHB101）2．目的基因與載體的連接

（c-myc＋pSV；粘端連接）3．重組質粒轉化大腸桿菌并篩選轉化體

（HB101；Ampr）實驗一 DNA重組與細胞轉化第二十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日二、基因工程技術的基本內容質粒載體（pSV）的構建目的基因（c-myc基因片段）的獲取載體與目的基因的連接（粘端連接）重組體導入受體細胞（CaCl2法制備感受態細胞）重組體的鑒定目的基因在細胞中的表達表達產物的分離、鑒定26第二十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日pBR322pSV3.5kbBamHIXbaIc-mycDNA片段4.8kbT4DNA連接酶大腸桿菌HB101CaCl2法感受態細胞轉化Amp平板轉化推板孵育過夜8.5kbBamHIXbaIpSV27第二十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日pSV-c-mycBamHIXbaIc-myc基因片段4.8kbpSV2載體片段3.5kbpSVcmyc1[pmetD](ATCC?41029?)-TCTAGA--AGATCT-粘性末端防止載體的自身環化目的基因定向插入28第二十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日目的基因（c-myc基因片段）的獲取c-myc基因是myc基因家族的重要成員之一c-myc基因與多種腫瘤發生發展有關本實驗采用的4.8kbc-myc基因位于2,3外顯子區域BamHI和XbaI雙酶切處理29第二十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日

載體與目的基因的連接構建重組子1.平端連接

增加DNA濃度或提高連接酶濃度以提高連接效率2.粘端連接

效率較高，加入連接酶后可立即轉化，即有轉化子出現3.粘-平連接30第三十頁，共三十九頁，2022年，8月28日連接酶的選擇：

T4DNA連接酶：適用粘端、平端連接

可用于DNA-RNA，RNA-RNA雜交體大腸桿菌DNA連接酶：適用粘端連接（也可用于平端，效率低）連接溫度：

一般12~16℃，也可提高溫度到22℃載體與目的基因的比例：

摩爾比約1：1~1：531第三十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日轉化：將異源DNA分子引入另一細胞，使受體細胞獲得新的遺傳性狀。感受態細胞：受體細胞經特殊方法（如電擊、CaCl2等處理，細胞膜的通透性發生改變，允許帶外源DNA的載體分子進入的狀態，稱之。轉化體的篩選：選擇性培養基

如：Amp抗性平板32第三十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日四、實驗步驟

（詳見實驗講義）

1.目的基因c-myc與pSV質粒載體的連接(粘端)目的基因片段（4.8kb），20ng/μl3μL載體DNA（3.5kb），20ng/μl1.5μL10×buffer1μLT4DNA連接酶（5U/μl)0.5μL

ddH2O4μL

總體積：10μL

混勻，22℃水浴中溫育1小時，4℃保存備用。

注意：加樣前短暫離心加樣順序保證每個樣品加入其中加樣完成后混勻后離心33第三十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日2.CaCl2法制備感受態細胞注意：最好在超凈工作臺內進行，或火焰旁5cm無菌圈注意無菌操作和冰浴離心前必須平衡34第三十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日倒入經冰預冷的15mL離心管，冰浴10min37℃振搖約2h，細菌長至云霧狀取0.1mL大腸桿菌HB101培養物，加至5mLLB培養液中4℃，4000rpm，離心10min棄上清，在紙巾上倒置1min，重懸于200μL0.1mol/LCaCl2分裝成50μL/管沉淀重懸于冰預冷的1mL，0.1mol/LCaCl2，混勻轉入1.5mL離心管，冰浴10min4℃，4000rpm，離心10min棄上清，在紙巾上倒置1min35第三十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日3.重組質粒轉化感受態細胞5μL連接產物或陽性對照質粒1μL分別加入50μL感受態細胞，冰浴30min42℃90sec立即冰浴1~2min分別加入LB培養液150μL，37℃振搖45min分別取100μL鋪板于含Amp的LB平板轉移要快，溫度要準確37℃溫箱培養過夜36第三十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日影響轉化效率的因素1.感受