基質(zhì)對(duì)土壤酸性磷酸酶活性測(cè)定的影響分析,農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué)論文

基質(zhì)對(duì)土壤酸性磷酸酶活性測(cè)定的影響分析,農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué)論文摘要：土壤酸性磷酸酶與有機(jī)磷的礦化及植物的磷素營(yíng)養(yǎng)關(guān)系最為密切。當(dāng)前國(guó)內(nèi)學(xué)者在測(cè)定酸性磷酸酶活性時(shí)主要參照關(guān)松蔭(土壤酶及其研究法〕中以磷酸苯二鈉為基質(zhì)的測(cè)定方式方法，而國(guó)外學(xué)者主要參照Dick(MethodsofSoilEnzymology〕中以對(duì)硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)的測(cè)定方式方法〔PNPP〕。但是，在以磷酸苯二鈉為基質(zhì)測(cè)定生成物的經(jīng)過(guò)中，常出現(xiàn)顯色程度不明顯的問(wèn)題；另外，采用不同基質(zhì)測(cè)定酸性磷酸酶活性也造成了測(cè)定方式方法選擇的困難。為合理選擇土壤酸性磷酸酶活性的測(cè)定方式方法，本研究選用酸性、中性和堿性土壤各10個(gè)土樣，分別采用以磷酸苯二鈉為基質(zhì)，且在顯色階段分別參加pH5.0醋酸鹽緩沖液〔DPP1〕和pH9.4硼酸鹽緩沖液〔DPP2〕的方式方法，以及PNPP方式方法測(cè)定土壤酸性磷酸酶活性。同時(shí)也研究了不同pH緩沖液和苯酚濃度對(duì)生成物顯色反響的影響。結(jié)果表示清楚：以磷酸苯二鈉為基質(zhì)、在顯色反響階段參加pH6的緩沖液時(shí)，苯酚和2,6-二溴苯醌氯亞胺不顯色；當(dāng)參加pH8的緩沖液時(shí)，兩者之間顯色且苯酚濃度和吸光值的Pearson相關(guān)系數(shù)極顯著。這講明pH低是導(dǎo)致高苯酚濃度和2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色效果差的一個(gè)主要原因。除此之外，采用PNPP方式方法測(cè)定時(shí)，在酸性、中性和堿性土壤中，10個(gè)樣本酸性磷酸酶活性的變異系數(shù)分別較DPP2增加了70.04%、42.44%和21.17%;極差分別是DPP2的27.18倍、26.85倍和39.43倍。總之，假如選用磷酸苯二鈉為基質(zhì)測(cè)定土壤酸性磷酸酶活性，應(yīng)在顯色階段參加堿性硼酸鹽緩沖液；選用對(duì)硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)，是更為簡(jiǎn)單和靈敏的方式方法。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：土壤酸性磷酸酶活性磷酸苯二鈉對(duì)硝基苯磷酸二鈉pH顯色土壤磷為植物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，華而不實(shí)有機(jī)磷所占比例達(dá)15%~80%[1].由于有機(jī)磷不能被植物直接吸收利用，進(jìn)而成為陸地生態(tài)系統(tǒng)一個(gè)主要的限制養(yǎng)分[2].磷酸酶可催化磷酸脂或磷酸酐的水解，其活性的高低直接影響有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性。華而不實(shí)酸性磷酸單酯酶與有機(jī)磷的礦化及植物的磷素營(yíng)養(yǎng)關(guān)系最為密切[3-4],且在酸性土壤中占優(yōu)勢(shì)[5].酶的提取比擬困難，對(duì)磷酸酶活性的測(cè)定主要是根據(jù)一定量的基質(zhì)在酶催化反響經(jīng)過(guò)中生成物或剩余底物量間接測(cè)得[6-7].自Kroll等最早提出用磷酸苯酯作基質(zhì)，以酚的釋放量表示磷酸酶活性以來(lái)[6],對(duì)土壤磷酸酶活性測(cè)定方式方法的改良主要圍繞基質(zhì)以及緩沖液的種類進(jìn)行。已報(bào)道采用的基質(zhì)包括天然的基質(zhì)〔主要是核酸〕、-萘基磷酸鈉、-甘油磷酸鹽、磷酸苯二鈉、對(duì)硝基酚磷酸鈉和酚酞磷酸鹽等[8-10].由于傳統(tǒng)的分光比色測(cè)定方式方法成本低，較熒光比色更具有普遍性。本研究主要關(guān)注適用于分光比色的磷酸酶基質(zhì)。在分光比色方式方法中，當(dāng)前國(guó)際上大部分學(xué)者使用對(duì)硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)測(cè)定磷酸酶的活性，且有研究表示清楚該方式方法是最快速且準(zhǔn)確的[9,11].有外文統(tǒng)計(jì)，在磷酸酶的動(dòng)力學(xué)特征研究中，有706個(gè)數(shù)據(jù)使用對(duì)硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)，而只要140個(gè)數(shù)據(jù)使用其他基質(zhì)[12].除此之外，當(dāng)前我們國(guó)家學(xué)者在研究中經(jīng)常用到的基質(zhì)是磷酸苯二鈉[13].雖早期有研究表示清楚，在pH6.5條件下采用磷酸苯二鈉測(cè)定磷酸酶活性時(shí)存在顯色不穩(wěn)定的問(wèn)題[11,14],但此測(cè)定方式方法已收錄在一些參考書(shū)中[15-18].且當(dāng)前在中國(guó)知網(wǎng)上可查閱到不少使用該基質(zhì)的文獻(xiàn)[19-20],在ScienceDirect網(wǎng)也有個(gè)別文獻(xiàn)[21-22].由于以磷酸苯二鈉為基質(zhì)測(cè)定磷酸酶活性的原理是基于磷酸苯二鈉經(jīng)磷酸酶水解后構(gòu)成的酚，在堿性條件下與顯色劑2,6-二溴苯醌氯亞胺反響，在酚羥基的對(duì)位引入醌亞胺生色基而生成蘭色的靛酚鹽[23-24].當(dāng)前國(guó)內(nèi)部分參考書(shū)在描繪敘述土壤酸性磷酸酶活性的測(cè)定方式方法時(shí)提到在培養(yǎng)以及顯色時(shí)均要參加醋酸鹽緩沖液，使苯酚與2,6-二溴苯醌氯亞胺在酸性條件下反響[16-18].但是(MethodsinSoilBiology〕中提到培養(yǎng)時(shí)參加醋酸鹽緩沖液，而顯色時(shí)參加硼酸鹽緩沖液，使最終顯色反響在堿性環(huán)境中進(jìn)行[25].國(guó)內(nèi)大部分學(xué)者所參考的關(guān)松蔭的(土壤酶及其研究法〕中，在介紹土壤磷酸酶活性的測(cè)定方式方法時(shí)，描繪敘述為測(cè)定酸性磷酸酶活性需采用酸性醋酸鹽緩沖液培養(yǎng)，而在顯色經(jīng)過(guò)中只提到參加緩沖液，詳細(xì)是硼酸鹽緩沖液還是醋酸鹽緩沖液，并未詳細(xì)講明[15].除此之外，本文作者和其他學(xué)者前期相關(guān)工作表示清楚，在采用磷酸苯二鈉為基質(zhì)加醋酸鹽緩沖液顯色的經(jīng)過(guò)中出現(xiàn)不顯色而影響酶活性測(cè)定的現(xiàn)象。故本研究以測(cè)定酸性磷酸酶活性時(shí)，酸性條件下不利于苯酚與2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色為假設(shè)，選用酸性、中性和堿性土壤來(lái)比擬基于磷酸苯二鈉為基質(zhì)在不同酸堿緩沖液條件下的顯色反響，同時(shí)把基于磷酸苯二鈉為基質(zhì)測(cè)定酸性磷酸酶活性的方式方法與對(duì)硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)的測(cè)定方式方法進(jìn)行靈敏性比擬，討論基質(zhì)對(duì)土壤酸性磷酸酶活性測(cè)定準(zhǔn)確性和靈敏性的影響。研究結(jié)果可為土壤酸性磷酸酶活性的測(cè)定以及方式方法的選擇提供根據(jù)，對(duì)改善土壤磷素營(yíng)養(yǎng)狀況具有重要意義。1材料與方式方法1.1供試土壤在土壤生物指標(biāo)的研究中，不能僅根據(jù)土壤pH的高低，就簡(jiǎn)單地選擇酸性磷酸酶或堿性磷酸酶單項(xiàng)指標(biāo)，在非酸性土壤中可以以利用酸性磷酸酶活性作為微生物活動(dòng)和功能的指標(biāo)。為研究不同類型的土壤對(duì)不同方式方法的敏感程度，本研究選擇pH在4~10范圍的3類土壤各10個(gè)土樣來(lái)測(cè)定不同土樣之間酸性磷酸酶活性的極差和變異系數(shù)。酸性土壤采自江西省分宜縣大崗山地區(qū)，pH為4.32~4.46,土壤類型是紅壤，植被類型是天然常綠闊葉林；中性土壤采自北京八達(dá)嶺林場(chǎng)，pH為6.26~7.35,土壤類型是棕壤，植被類型主要是油松〔PinustabulaeformisCarr.〕；堿性土壤采自海拔4200m以上的青海果洛藏族自治州瑪多瑪查理鎮(zhèn)，pH為9.59~10.05,土壤類型是草甸土，植被類型以草原為主。1.2土壤酸性磷酸酶活性的測(cè)定方式方法以磷酸苯二鈉〔C6H5Na2O4P,CAS編號(hào):3279-54-7〕為基質(zhì)的測(cè)定方式方法根據(jù)中國(guó)學(xué)者廣泛參考的(土壤酶及其研究法〕的方式方法[15]略作修改，采用兩個(gè)方式方法進(jìn)行酸性磷酸酶活性的測(cè)定：一種是在顯色時(shí)同書(shū)中介紹的加磷酸苯二鈉溶液的方式方法一致，參加酸性醋酸鹽緩沖液〔DPP1〕；另一種是顯色時(shí)參加堿性硼酸鹽緩沖液〔DPP2〕，兩種緩沖液的配制以及操作步驟參照書(shū)中所介紹的方式方法[15].以對(duì)硝基苯磷酸二鈉〔C6H4NNa2O6P6H2O,CAS編號(hào)：4264-83-9〕為基質(zhì)的方式方法參照(MethodsofSoilEnzymology〕中介紹的方式方法〔PNPP〕[11].稱取1.00g土壤后以甲苯為抑制劑，添加4mLpH6.5改良的通用的緩沖液[每升緩沖液中含有12.1g三羥甲基氨基甲烷〔C4H11NO3〕，11.6g馬來(lái)酸〔C4H4O4〕，14.0g檸檬酸〔C6H8O7〕，6.3g硼酸〔H3BO3〕和19.52g氫氧化鈉〔NaOH〕],和1mL對(duì)硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)溶液后于37℃下培養(yǎng)1h.培養(yǎng)結(jié)束后，添加CaCl2和NaOH溶液，并將濾液于400nm處比色測(cè)定。按文獻(xiàn)介紹的方式方法對(duì)照試驗(yàn)有所差異：DPP1和DPP2設(shè)立無(wú)基質(zhì)對(duì)照和無(wú)土壤對(duì)照；PNPP設(shè)立后加基質(zhì)對(duì)照。為消除空白差異對(duì)結(jié)果的影響，本研究統(tǒng)一設(shè)立無(wú)基質(zhì)對(duì)照和無(wú)土壤對(duì)照。經(jīng)測(cè)定，DPP1、DPP2和PNPP無(wú)土壤對(duì)照吸光值分別是0.070、0.112和0.108.1.3緩沖液pH和苯酚濃度對(duì)顯色反響影響的測(cè)定為了解不同pH緩沖液對(duì)不同濃度苯酚和2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色構(gòu)成蘭色靛酚鹽的影響，采用pH分別為4.0、6.0、8.0的醋酸鹽緩沖液和pH10.0的硼酸鹽緩沖液測(cè)定苯酚濃度分別為0gmL-1、1gmL-1、2gmL-1、3gmL-1、4gmL-1和6gmL-1的吸光值。每個(gè)處理3次重復(fù)。1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析吸光值數(shù)據(jù)采用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同土樣吸光值的差異，采用SPSS18.0進(jìn)行LSD差異性檢驗(yàn)。不同pH緩沖液下不同苯酚濃度的吸光值采用雙因素交互作用分析。苯酚以及對(duì)硝基酚濃度與吸光值的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分