DNA、RNA的生物合成課件

核酸的合成分子生物學(分子遺傳學)中心法則

反映了從DNARNA蛋白質的遺傳信息主流，揭示了生物體內遺傳信息的貯存、傳遞和表達的規律。轉錄RNA翻譯蛋白質DNA

RNA（病毒）復制復制翻譯蛋白質（病毒）反轉錄第一節DNA的生物合成

DNA→DNADNA復制

RNA→DNA反轉錄兩種方式一、DNA的半保留復制2.半保留復制的實驗證據:1.定義：1958年Meselson和Stahl用同位素15N標記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復制。以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補方式合成子代DNA，這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復制方式叫半保留復制。第十二章DNA復制與修復DNA半保留復制DNA的復制的方式------1958,MesselsonandStahl實驗證實細菌的DNA雙鏈(藍線的代表含15N)含15N-DNA的細菌培養于普通培養液第一代重DNA普通DNA普通DNADNA半保留復制的證據混合式重DNA普通DNA重DNA第二代半保留式第一代故可排除混合式復制方式細菌的DNA雙鏈(藍線的代表含15N)(紅線的代表含14N)含15N-DNA的細菌培養于普通培養液繼續培養于普通培養液第二代重DNA第一代重DNA普通DNA普通DNADNA半保留復制的證據排除混合式Why?必須具備的基本條件

模板：母鏈DNA

原料：dNTP(包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP)

酶和蛋白質因子：

引物：一小段RNA

能量（ATP）及某些無機離子參與DNA復制的酶類與蛋白質因子及其主要作用1.拓撲異構酶（topoisomerase,Topo）

無ATP時：作用相當于TopoⅠ,但切割的是雙鏈DNA某一部位(斷雙鏈)。

有ATP時：使帶斷口、松弛狀的DNA分子旋緊轉變成負超螺旋結構，再連接斷端。不需耗能(ATP)，切割(斷)雙鏈DNA中的一鏈，松解螺旋,封閉切口。又稱切割封口酶。TopoⅠ的作用TopoⅡ(又稱旋轉酶)的作用拓撲異構酶II+ATP拓撲異構酶IDNA的松弛狀態與超螺旋3.單鏈DNA結合蛋白(DNA結合蛋白)(singlestrandedDNA-bindingprotein,SSB)作用：防止重新形成雙鏈和防止單鏈模板被核酸酶水解,維持DNA單鏈狀態和完整性4.引物酶(Primase)5′3′

5′RNA引物5′5′RNA引物3′RNA的合成：需引物酶，它是一種特殊的RNA聚合酶。

DNA不能從無→有合成，需在一小段RNA基礎上合成DNA5.DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol）

即依賴于DNA的DNA聚合酶（DDDP）

原核生物（E.coli）迄今已知只有3種：DNApolⅠ、DNApolⅡ、DNApolⅢ。真核生物

亦發現有多種DDDP：DDDP、、、、。其性質與功能大腸桿菌中DNA聚合酶某些性質────────────────────────

DNA聚合酶性質----------------------------------------------------

ⅠⅡⅢ────────────────────────酶分子/細胞

400

40

20酶分子量(kd)109901405'→3'聚合功能有有有5'→3'外切酶活性有有

無3'→5'外切酶活性有有有聚合核苷酸數/分鐘/分子(37℃)10005015000主要功能修復等修復作用復制────────────────────────表13-2真核細胞中DNA聚合酶的性質─────────────────────

DNA聚合酶性質-------------------------------------------------------

αβγδε─────────────────────分布

細胞核細胞核線粒體細胞核細胞核分子量(kd)>25036-38160-3001702563’→5’外切酶活性無無有有有5’→3’聚合作用有有有有有主要功能復制損傷修復復制復制復制,損傷修復

(隨從鏈)(領頭鏈)─────────────────────DDDP5′3′聚合作用示意圖3′模板鏈

5′5′3′6.DNA連接酶(DNALigase)作用：在有模板指導的條件下，催化2個DNA片段(兩片段間的距離為1個3',5'-磷酸二酯鍵的鍵長)的連接。原理：在一個DNA片段的3'-OH末端和另一個DNA片段的5'-P末端形成3',5'-磷酸二酯鍵，從而實現連接。特點：原核細胞:需輔助因子NAD+

真核細胞:不需輔助因子NAD+,但需耗能(ATP)

DNA的復制過程

復制的起始鏈的延長復制的終止復制的起始1.在拓撲異構酶、解鏈酶及單鏈DNA結合蛋白的共同作用下，DNA解旋、解鏈，形成復制叉。2.依賴于單鏈模板，由引物酶催化按堿基配對規律合成一小段RNA引物(原核細胞引物長50-100個堿基，真核約10個堿基)。

DNA的復制過程：（以大腸桿菌為例）復制的終止：復制的起始1、起始復合物的形成：稱為引發2、RNA引物的合成鏈的延伸：復制起始階段的特點真核細胞：具有多個起始位點原核細胞：僅有一個復制起始位點，但往往是雙向復制鏈的延長引物合成后，由DNApolⅢ（真核細胞為DNA聚合酶或)催化，在引物3'-OH末端逐一添加與模板鏈對應互補的脫氧核苷磷酸,使新合成的鏈不斷延長。前導鏈:鏈的延長方向(5'

3')與解鏈方向(復制叉移動方向)相同,為連續合成。隨從鏈:

鏈的延長方向(5'3')與解鏈方向(復制叉移動方向)相反，為不連續合成。分段合成的DNA片段,最初被命名為岡崎片段III三、DNA復制的半不連續性前導鏈滯后鏈岡崎片段前導鏈：以3’→5’方向的親代鏈為模板連續合成的子代鏈。滯后鏈：以5’→3’方向的親代鏈為模板的子代鏈先逆復制叉移動方向合成岡崎片段，再連接成滯后鏈。DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種5’-脫氧核苷三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時進行前導鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

前導鏈滯后鏈岡崎片段半不連續復制岡崎模型復制的終止1.水解引物及填補空隙岡崎片段合成后，由DNApolⅠ(真核細胞可能是DNA聚合酶)水解去除RNA引物，并填補留下的空隙(5'3')聚合。2.完整雙鏈DNA分子的形成

填補空隙后，DNA片段與片段之間還有一個缺口(一個3',5'-磷酸二酯鍵的長度),由DNA連接酶催化連接成完整的鏈，從而產生完整的雙鏈DNA分子。DNA復制的精確性（高保真復制）1、堿基的配對規律：摸板鏈與新生鏈之間的堿基配對保證堿基配錯幾率約為1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校對功能，使堿基的錯配幾率又降低100～1000倍。3、DNA的損傷修復系統。DNA復制必須具有高度精確性，在大腸桿菌的細胞DNA復制中其錯誤率約為1/109～1/1010，即每109～1010個核苷酸才出現一個錯誤，也就是大腸桿菌染色體DNA復制1000～10000次才出現一個核苷酸的錯誤。這么高的精確性的保證主要與下列因素有關：二、反轉錄

(reversetranscription)概念

以RNA為模板，dNTP為原料，反轉錄酶催化，按堿基配對規律合成DNA的過程。

反轉錄酶,又稱為依賴RNA的DNA聚合酶(RNA-dependentDNApolymerase,RDDP)DNA轉錄RNARNA(病毒)反轉錄....................RDDP引物,4種dNTPRDDPRNaseH4種dNTPRDDP或DDDP病毒RNARNA-DNA雜化分子cDNA前病毒(雙鏈DNA)酶催化反應示意圖反向轉錄酶存在于所有致癌RNA病毒中,其功能可能與病毒的惡性轉化作用有關;但它也存在于某些正常細胞中，在細胞分化與胚胎發生中可能起某些作用。反轉錄病毒和反轉錄酶的發現,提出了一個重要的醫學問題──病毒致癌及癌基因

反轉錄的醫學意義反轉錄的醫學意義癌基因(oncogene):能在體外引起細胞惡性轉化,在體內誘發腫瘤的基因.細胞癌基因(c-onc)或原癌基因(pro-onc):存在于生物正常細胞基因組中的癌基因.正常情況下基因處于靜止或低表達的狀態.當受到致癌刺激被活化并發生異常時則可發生細胞癌變.病毒癌基因(v-onc):存在于致瘤病毒中的能使靶細胞發生惡性轉化的基因.用三個小寫字母表示癌基因名稱,如myc,fos,ras,src等抑癌基因:是一類抑制細胞過度生長,增殖從而遏制腫瘤形成的基因.如Rb,P53,P16等癌基因與抑癌基因之間一般處于動態平衡狀態是一種反轉錄病毒,可引起獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS,艾滋病).反轉錄酶在基因工程,分子病的基因治療方面也有重要作用.人類免疫缺陷病毒(HIV)反轉錄的醫學意義第二節DNA的損傷與修復一、DNA的損傷生物體受某些理化和生物等外源性因素或機體內環境改變的影響，引起DNA分子結構的任何異常改變稱為DNA損傷(DNAdamage)概念ONHNOCH3RPONHNOCH3RONHNOCH3RPNHNOROCH3UV引起DNA損傷的因素紫外線(常產生嘧啶二聚體)電離輻射(斷磷酸二酯鍵)

物理因素胸腺嘧啶二聚體的產生化學因素：均能干擾復制與轉錄功能▲烷化劑：(如氮芥類,CTX)，使鳥嘌呤的

N7烷基化后脫落，成為無鳥嘌呤的位點▲亞硝酸鹽：使堿基脫氨原G-C配對最終變為A-T配對，導致錯配C→UA→IG→XCOHNCCHCHNOUCONCCHCHNNH2CANNH2NNNNOHNNNIN

OHNNNHH2NGN

OHNNNHHOX化學因素：均能干擾復制與轉錄功能▲烷化劑：(如氮芥類,CTX)，使鳥嘌呤的

N7烷基化后脫落，成為無鳥嘌呤的位點▲亞硝酸鹽：使堿基脫氨原G-C配對最終變為A-T配對，導致錯配C→UA→IG→X▲絲裂霉素：與DNA共價連接引起鏈交聯目前多指病毒糖苷鍵自行斷裂；自發脫氨基作用,CU，AI。生物因素生理因素機率極低突變(mutation)：有機體基因組可遺傳的改變，即DNA序列的改變.根據引發的原因，可將突變分為：

誘發突變和自發突變。

缺失根據DNA分子的改變，突變可分為4類：點突變顛換：異型堿基間變異,

轉換：同型堿基間變異,缺失或插入的堿基數不是3的整倍數時，則引起移碼突變插入倒位(或易位)基因突變可能出現的后果生物體致死生物體某些功能喪失僅改變基因型，表現型不受影響改變生物物種，出現新的生物特征

DNA復制過程所發生的突變(堿基配對錯誤)，由核內DNA聚合酶Ⅰ以其校讀功能予以糾正.若堿基錯配頻頻發生或損傷范圍大，則需采用以下修復方式進行修復.二、DNA損傷的修復TT光復活酶（可見光）T+TDNA修復方式1.光修復:2.切除修復：由3種酶共同參與完成。特異性核酸內切酶DNApolIDNA連接酶5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'復制重組DDDPIDNA連接酶重組修復過程3.重組修復：亦稱復制后修復4.SOS修復：DNA分子受到較大范圍的損傷，細胞對危急狀態所作出的反應。機制引起DNA較長期的、廣泛的突變。SOS調節網誘導產生的DNA聚合酶特異性低，識別堿基能力差,使修復部位仍存在較多錯配的堿基，但細胞能繼續生存。后果第二節RNA的生物合成

DNA→RNA轉錄

RNA→RNARNA復制兩種方式存在于絕大多數生物體存在于某些病毒體內一、轉錄（一）概念在DNA指導的RNA聚合酶催化下，以DNA的模板鏈為模板，4種NTP為原料，按堿基配對規律(T-A,A-U,G-C)合成一條與模板鏈互補的RNA鏈的過程。⒈RNA聚合酶常稱為轉錄酶(transcriptase)其全稱為：DNA依賴的RNA聚合酶(DNA-dependentRNApolymerase,DDRP)▲

E.Coli的DDRP由5個亞基組成（二）參與轉錄的酶和有關因子+σ因子α2ββ'(核心酶)σα2ββ'(全酶)表13-6大腸桿菌RNA聚合酶亞基組成及其功能────────────────────────類型亞基/酶分子主要功能────────────────────────

α2決定哪些基因被轉錄β1參與轉錄的全過程β'

1與模板DNA結合被利福平

σ1識別轉錄起始點被利福霉素────────────────────────核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)RNA聚合酶全酶在轉錄起始區的結合真核生物DDRP的種類與功能種類存在部位轉錄產物對鵝膏蕈堿的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁45SrRNA不敏感RNA聚合酶Ⅱ核質hnRNA和snRNA極敏感RNA聚合酶Ⅲ核質tRNA和5S-rRNA中度敏感DDRP無3’→5’外切酶活性,有什么結果?RNA聚合酶的主要功能能識別并結合于DNA模板的啟動子部位（真核生物還需要轉錄因子的幫助）解開轉錄起始點下游一小段(約17bp)DNA雙螺旋，產生單鏈模板;不需引物，催化形成第一個3',5'-磷酸二酯鍵，沿5'→3'方向延伸RNA鏈能識別DNA模板上的轉錄終止信號(依賴于σ因子)在基因表達中，參與轉錄水平的調控⒉ρ因子(Rhofactor)功能(1)能幫助DDRP識別終止信號并停止轉錄(2)具有ATP酶和解鏈酶活性，使RNA-DNA雜化分子解鏈，從而釋放轉錄產物RNA分子3.轉錄的DNA模板細胞內DNA不是其全長都可作為轉錄模板DNA雙鏈中，可作為模板轉錄成RNA的一條鏈，稱為模板鏈(或反意義鏈)同一DNA雙鏈中與模板鏈相對(互補)的一條鏈稱為編碼鏈(或有意義鏈)，可見轉錄是不對稱的模板鏈=反意義鏈=負鏈編碼鏈=有意義鏈=正鏈為何稱模板鏈為反意義鏈，編碼鏈為有意義鏈？可從下圖理解：

５'

…GCAGTACATGTC…3'

編碼鏈3'…CGTCATGTACAG…５'

模板鏈DNA轉錄５'…GCAGUACAUGUC…3'

mRNA翻譯N…丙－纈－組－纈…C肽比較編碼鏈和RNA鏈的堿基序列可見，除了以Ｕ代Ｔ外，其余均一致。基因組序列均以編碼鏈(正鏈)表示.不對稱轉錄的兩方面含義：5'

3'

3'

5'

模板鏈（含結構基因）編碼鏈DNA分子上的一條鏈可轉錄，另一條不轉錄模板鏈并非永遠在同一單鏈上1.啟動子（promoter）RNA聚合酶與模板DNA結合的特定部位，是基因轉錄的開始部位。一般可分為兩類DDRP能直接識別的啟動子需蛋白質輔助因子的幫助，DDRP才能識別的啟動子（四）啟動子及終止信號確保轉錄精確而有效地起始的DNA序列原核生物啟動子的3個功能部位轉錄起始點,常標以+1,第1個核苷酸為嘌呤核苷酸(A或G).上游或下游,+或-表示結合部位,長度為7bp,位于-10bp處,有一共有序列(-TATAAT-,Pribnow盒)RNA聚合酶的識別部位,由約6bp,位于-35bp,

也有共有序列(-TTGACA-)編碼鏈5'

3'啟動子5'

MeGPPPRNA產物原核生物啟動子轉錄起始部位+1基因轉錄區-10區TATAATPribnow盒結合部位TGTTGACA-35區識別部位DNA模板鏈3'

5'編碼鏈5'

3'DNA模板鏈3'

5'CCAATCAAT盒-70真核生物啟動子RNA產物轉錄起始部位+1基因轉錄區TATATATA盒-25Hogness盒結合部位GAGCCACCCGC盒(少數)2.終止信號(終止子)DNA分子中決定RNA聚合酶終止轉錄的特定堿基序列。原核生物終止信號堿基組成特點有反向重復序列決定轉錄產物的回折形成莖-環(或稱發夾)結構AT富集區GC富集區反向重復序列AT富集區GC富集區一般認為由終止子引導的轉錄終止是不依賴ρ因子的(五)轉錄過程起始延長終止(以大腸桿菌的轉錄為例）1.轉錄起始形成轉錄空泡（DNA解鏈長約20bp)DDRP(σ亞基)辨認并結合于啟動子部位由DDRP催化，頭2個NTP直接在起始點形成第一個磷酸二酯鍵(不需引物，由模板指導),形成轉錄起始復合物σ亞基脫落（參與下一輪轉錄）由核心酶(α2ββ')催化鏈的延伸第一個總是GTP全酶(σα2ββ')-DNA模板(啟動子)-pppGpN'-OH3'5'DNA5'3'DNA起始點RNA聚合酶pppGpppN'pppN''5'pppGpN'轉錄起始時pppGpN-OH的生成CN3'5'模板鏈`CN3'5'模板鏈進一步延長起始2.鏈的延長轉錄起始時形成的“轉錄泡”仍保留RNA鏈的延長由核心酶催化核心酶沿模板鏈3'→5'方向移動，RNA鏈按堿基配對規律沿5'→3'方向延伸新生鏈與模板鏈形成雜化雙鏈(該雜化分子結構不穩定，RNA鏈游離后，DNA雙鏈重新形成)隨“轉錄泡”和DDRP不斷移動(單鏈模板不斷暴露)，轉錄連續不斷地進行

要點

3.轉錄終止依賴因子的終止不依賴于因子的終止依賴因子的終止作用機理

作用機理：終止信號區特殊堿基序列決定RNA形成發夾形二級結構，這是阻止轉錄繼續向下游推進的關鍵；

RNA-DNA雜化雙鏈不穩定因素：

DNA復性，RNA自身形成雙鏈；

RNA3'端，連續多個不穩定的rU：

dA

堿基配對，使轉錄復合體解體。

不依賴因子的終止RNA5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3

DNAUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`莖環(stem-loop)/發夾(hairpin)結構莖環結構使轉錄終止的機理使RNA聚合酶變構，轉錄停頓；使轉錄復合物趨于解離，RNA產物釋放。5′pppG5335RNA-pol轉錄過程二、真核生物的轉錄后修飾幾種主要的修飾方式1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.修飾(modification)4.添加(addition)一、真核生物mRNA的轉錄后加工（一）首、尾修飾

5端形成帽子結構(m7GpppGp—)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)帽子結構5pppGp…5GpppGp…pppG

ppi鳥苷酸轉移酶5

m7GpppGp…甲基轉移酶SAM帽子結構的生成5ppGp…磷酸酶

Pi（二）mRNA內含子的剪接

1.hnRN