LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡介

LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡介

一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設(shè)計原理

報告質(zhì)粒p8op-LacZ的GAL4UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激

活劑的情況下,報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄活性為零，該基因的篩選標(biāo)志為URA3,可以作為有

自主復(fù)制能力的質(zhì)粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。

質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于表達(dá)DNA-BD（202個氨基酸殘

基組成的LexA蛋白）與目標(biāo)蛋白（釣餌，Bait）的融合蛋白，該融合體的表達(dá)受酵母強(qiáng)啟動子

ADH1的調(diào)控，選擇與報告基因的操縱子LexAx8結(jié)合。

質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為TRP1在其供外源基因插入的多克隆位點（EcoRI與Xho

I）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）,HA（血凝素）及AD（來自于的88

個氨基酸殘基組成的B42蛋白）等幾種編碼序列,共同組成可以啟動報告基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的激

活成份。

在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個報告基因Leu,它與LacZ報告基因具有相

同的操縱子-LexA，但兩者啟動子不同。

根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復(fù)合物同時具有DNA-BD和AD的活性，即可激活

報告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。分別將待測蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD

質(zhì)粒載體的多克隆位點中，然后共同轉(zhuǎn)入含有報告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相

互作用，則啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，通過檢測報告基因的表達(dá)情況，就可以間接反映

蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強(qiáng)弱。

如果將雷白Y換為取自絹織或血液的cDNA文庫，則可用X從該文庫中篩選出能與其

相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的

cDNA0

二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的組成

載體質(zhì)粒：、、文庫

1.pLexApB42ADp8op-LacZxpB42AD-DNA

2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ\YM4271（EGY48的伴侶菌株）

3.大腸桿菌菌株：KC8株

4.對照質(zhì)粒：

質(zhì)粒用途

pLexA-53,pB42AD-T陽性對照

pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白〕陽性對照

pLexA-Lam（LaminC蛋白少與其它蛋白相互作用）假陽性檢測質(zhì)粒

5.引物：

pLexA測序引物及pB42AD測序引物。

三、酵母雙雜交實驗的基本流程

1.將報告基因p8op-LacZ轉(zhuǎn)化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。

2.同時構(gòu)建或擴(kuò)增DNA文庫，并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。

3.構(gòu)建DNA-BD搬蛋白質(zhì)粒pLexA-X，作為釣餌(bait)。

4.將上述釣餌質(zhì)粒pLexA-X轉(zhuǎn)化EGY48(p8op-LacZ)細(xì)胞株，用SD/-His/-Ura篩

選，并用固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gdl/Rdf/-His/-Ura檢測此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激

活報告基因的5舌性，以及對酵母細(xì)胞是否具有殺傷毒性。

轉(zhuǎn)化質(zhì)粒選擇培養(yǎng)基克隆生長情況說明

(含有Gal/Raf)

pLexA-PosSD/-His,-Ura藍(lán)陽性對照

pLexASD/-His,-Ura白陰性對照

PlexA-XSD/-His,-Ura白沒有直接激活活性

PlexA-XSD/-His,-Ura藍(lán)具有直接激活活性

PlexA-XSD/-His,-Ura菌落不能生長酵母細(xì)胞毒性

4-1.如果pLexA-X-半孚苜酶的信號作用。能夠自動激活報告基因，則設(shè)法去除

其激活活性部位、或者將LacZ報告基因整合入基因組，減少

4-2.如果pLexA-X雖然不會自動激活報告基因"日對酵母宿中細(xì)胞有毒性，則需要

與純化的文庫DNA同時轉(zhuǎn)化酵母。

5.如果pLexA-X既不會自動激活報告基因也不具有毒性則可以與純化的文庫DNA

同時、或JII頁序轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。

轉(zhuǎn)化質(zhì)粒SD固體培養(yǎng)基LacZ表型

對照1pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura藍(lán)

對照2pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu藍(lán)

+pB42AD-T

實驗pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待測

+pB42AD-文庫

5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽性共轉(zhuǎn)化子，并擴(kuò)增,使宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒

在誘導(dǎo)前達(dá)到最大拷貝數(shù)。

-半乳糖首酶無表達(dá)。5-2.上述重組子轉(zhuǎn)至含X-gal的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基

SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu,觀察LacZ及Leu報告基因的表達(dá)情形，藍(lán)色克隆即

為陽性。白色克隆為假陽性，說明Leu雖有表達(dá)，但

5-3.同時用LacZ、Leu兩個報告基因的目的，是為了盡可能消除實驗的假陽性誤差，

望如：AD融合雷白不與目標(biāo)雷白結(jié)合，而直接與啟動子序列結(jié)合域結(jié)合等情況。由于2

個報告基因的啟動子不同，出現(xiàn)上述假陽性的幾率就大大減少了。

5-4.將藍(lán)色陽性克隆進(jìn)行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫質(zhì)粒。

6.陽性克隆的篩選

6-1.隨機(jī)選取50個陽性克隆，擴(kuò)增、抽提酵母質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化KC8宿主菌，抽提大

腸桿菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫質(zhì)粒。

6-2.如果重復(fù)的插入序列較多，可另取50個陽性克隆來分析。最后得到數(shù)種片段大

4環(huán)同的插入序列，再轉(zhuǎn)化新的宿主細(xì)胞，檢測是否仍為陽性克隆。

7.用質(zhì)粒自然分選法(NaturalSegregation)篩除只含有AD-文庫雜合子的克隆

7-1,將初步得到的陽性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2天，含有HIS3

編碼序列的BD-靶質(zhì)粒在含有外源His培養(yǎng)基中,將以10%-20%左右的頻率隨機(jī)丟失。

C孵育2-3天。7-2.將上述克隆，轉(zhuǎn)鋪固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ura,30

7-3.再挑取生長的單克隆，轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩

選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫雜合子的重組子。

7-4,將His表型缺陷的克隆轉(zhuǎn)化固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura以驗證AD-

文庫能否直接激活報告基因的表達(dá)，棄去陽性克隆，保留陰性克隆。

8.酵母雜合試驗(YeastMating)確定真陽性克隆

如下表所示，在酵母EGY48及其對應(yīng)的YM4271宿主細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的質(zhì)粒或

文庫DNA，通過雜合實驗確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫確實具有相互作用的真

陽性克隆。

質(zhì)粒1

(inYM4271)質(zhì)粒2

(inEGY48)LacZ表型Leu表型

pLexApB42AD白不能生長

pLexA-靶DNApB42AD白不能生長

pLexApB42AD-文庫白不能生長

pLexA-靶DNApB42AD-文庫藍(lán)真陽性

pLexA-LampB42AD-文庫白不能生長

9.陽性克隆的進(jìn)一步篩選和確證

9-1.擴(kuò)增初步確定的陽性克隆，抽提酵母DNA。該DNA為混合成份，既含有酵母

基因組DNA,也含有3種轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。

9-2.將卜述DNA電轉(zhuǎn)化KC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，具有不同復(fù)制起始調(diào)捽

序列的質(zhì)粒不相容；同時利用營養(yǎng)缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含

有AD-文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才能生長，將其擴(kuò)增、并抽提質(zhì)粒DNA,酶切鑒定。

9-3.用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫DNA一一對應(yīng)、共轉(zhuǎn)化只含有報告基因的酵

母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴(kuò)增，并與后面的誘導(dǎo)板形成對照，說明報

告基因的表達(dá)與誘導(dǎo)AD融合蛋白的表達(dá)有關(guān)，再確證LacZ、Leu報告基因的表達(dá)。

9-4.擴(kuò)增與靶DNA相互作用的文庫DNA,進(jìn)行序列分析及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)、功能研

究。

10.對雙雜交系統(tǒng)陽性結(jié)果的進(jìn)一步研究

10-1.用不同的雙雜交系統(tǒng)驗證

將載體pLexA與pB42AD互換后進(jìn)行雙雜交實驗。

10-1-2.選擇不同的雙雜交系統(tǒng)，如：以GAL4轉(zhuǎn)錄激活子為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)。

10-1-3.將文庫質(zhì)粒移碼突變后，再與靶質(zhì)粒作用，報告基因是否仍能被激活。

-半乳糖昔酶水平，比較作用強(qiáng)度變化。10-1-4.去除或突變特定結(jié)合位點，定量檢

測

10-2.用試劑盒提供的引物測定插入片段的DNA序列，證明其編碼區(qū)域。

10-3.用其它的檢測方法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來證明雙雜交系統(tǒng)篩選的

蛋白之間的具有相互作用。

10-4.進(jìn)一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功能關(guān)系

構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的擴(kuò)增

1.自-8CTC冰箱取出含有cDNA文庫的甘油菌，置于冰浴中緩慢化凍。

2.用新鮮的LB培養(yǎng)液在離心管中將上述甘油菌1:106和1:108稀釋。

II加入903.取稀釋菌液各1090mm）37℃倒置培養(yǎng)過夜或30℃培養(yǎng)24-36hr,

計數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。LB培養(yǎng)液在離心管中振蕩混勻，涂布LB/Amp平板（

4.確定待擴(kuò)增的cDNA文庫滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)xl08（l:106稀釋）或克隆數(shù)

x1010（1:108稀釋）。

5.按照＞150mm），共100塊；37。（：倒置培養(yǎng)過夜。2-4xl04cfu/平板的濃度，涂

布LB/Amp平板（

6.在超凈工作臺上，在所有生長菌落的平板上加適量LB培養(yǎng)液，將菌落刮下，轉(zhuǎn)入

2000mlLB/Amp培養(yǎng)液中，37（振蕩培養(yǎng)2-4hr。

7.留取適量培養(yǎng)菌液以50%無菌甘油稀釋至25%終濃度，分裝，保存于-80℃。

8.其余培養(yǎng)菌液離心8000xgxl0min,4P收集細(xì)菌；用質(zhì)粒DNA純化試劑盒大量

抽提質(zhì)粒DNA。

LB液體培養(yǎng)基，121℃,15lb/in2滅菌15min

A.bacto-Tryptone

B.bacto-YeastExtract

C.NaCI

D.ddH2O-1000ml

*LB固體培養(yǎng)平板為含有％瓊脂(Agar)LB培養(yǎng)基。

**LB/Amp培養(yǎng)基為含有Ampg/ml的LB培養(yǎng)基。50-100

構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的純化

1.質(zhì)粒DNA提取緩沖液

名稱緩沖液配方

g/mlRNasePl懸浮緩沖液50mMTris-HCI;10mMEDTA;100A

P2裂解緩沖液200mMNaOH;1%SDS

P3中和緩沖液Kac

QBT平衡緩沖液750mMNaCI;50mMMOPS;15%異丙醇；%TritonX-100

QC洗滌緩沖液MNaCI;50mMMOPS;15%異丙醇

QF洗脫緩沖液MNaCI;50mMTris-HCI;15%異丙醇

2.培養(yǎng)菌液離心6000xgxl0min,4。（：，每500ml培養(yǎng)物（下同）的沉淀重懸于50ml

Pl緩沖液。

3.加入50mlP2緩沖液，倒置4-6次混勻,室溫孵育5min.

4.加入4。（2預(yù)冷的50mlP3緩沖液，快速倒置4-6次混勻，冰浴30min（其間再倒置

混勻4-6次）。

5.將上述混合液再倒置混勻，離心12000xgx30min,4℃,保留上清。

6.上清再離心12000xgxl5min,4℃,留上清。

7.將上清液上樣于經(jīng)35mlQBT緩沖液平衡的QIAGEN-tip層析柱。

8.以100mlQC緩沖液洗滌層析柱2次。

9.以35mlQF緩沖液洗脫吸附于層析柱上的DNA。

10.以倍體積異丙醇沉浮DNA,離心12500xgx30min,4℃,小心夫除卜清。

11.以7ml70%乙醇洗滌沉淀DNA,離心12500xgxl0min,4℃,小心去除上清。

12.將沉淀的質(zhì)粒DNA溶于5mlTE緩沖液，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中,用倍體積無

水乙醇；1/10體積NaAc,于-20。(：靜置過夜。

13.離心12500xgx20min,4℃,去除_L清，沉淀用70%乙醇洗滌,超凈臺風(fēng)干。

I)，保存于-20。&g/管(用于1次轉(zhuǎn)化反應(yīng)，約4014.干燥的DNA溶于適量體

積TE,定量，分裝100-200

構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

1.將酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接種于SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然

后轉(zhuǎn)入SD/-Ura液體培養(yǎng)基中,30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr,至OD600>e

SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃,10lb/in2滅菌15min

A.DifcoNitrogen

B.葡萄糖

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xHis

E.20xLeu

F.20xTrp

G.ddH20-

2.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD至OD600=約50ml),30℃恒溫250rpm

振蕩培養(yǎng)至OD600=約3h)

YPD液體培養(yǎng)基，115℃,10lb/in2滅菌15min

A.Polypepton

B.bacto-YeastExtract

C.葡萄糖

D.ddH2O-300ml

3.室溫離心5000xgx5min，棄上清加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞,

離心棄上清，沉淀用IxTE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)泡。

4.準(zhǔn)備下列試劑

2x轉(zhuǎn)化反應(yīng)10xTElOxLiAc50%PEGddH2O

II/120I15A.lxTE/LiAc15

I/I960I120B.PEG/LiAc120

II//900C.lxTE100

5.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA,振蕩混勻。

Ig）3-5A.pLexA-X

B.lOmg/mlISpermDNA*10

*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。1

I用IxTE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。6.每管加入100

I7.各加入600PEG/LiAc,振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30mino

I8,各加入70DMSO緩和倒置混勻。42。（2熱休克15min,迅速插入冰浴。

9.室溫離心13000xgxl0sec,盡量棄上清似lxTE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura,

-His固體培養(yǎng)板，30。（：倒置培養(yǎng)3-5天。

SD/-Ura,-His固體培養(yǎng)基,115℃,10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板

A.DifcoNitrogen

B.

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xLeu

E.20xTrp

F.Agar

G.ddH2O90-100mm)一鋪8-10塊平板(

附表1.不同規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

SmallScale*LargeScaleLibraryScale

轉(zhuǎn)化反應(yīng)2011

(1)SD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增醉母菌100ml100ml300ml

(2)YPD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌300mla300mlalOOOmla

(3)TE或ddH20洗滌酵母細(xì)胞15mlc25-50mlb500mla

(4)準(zhǔn)備A.lxTE/LiAc緩沖液

B.PEG/LiAc緩沖液

C.lxTE緩沖液

(5)分裝A.DNA-BDvectorgdx20/

gd10-50B.ADvector

C.I1x20200SpermDNA(10mg/ml)10

IxTE/LiAc重懸感受態(tài)細(xì)胞

1x20酵母感受態(tài)細(xì)胞100

(7)PEG/LiAc緩沖液x20

Jl1x20700DMSO70

(9)室溫離心后棄上清13000xgxl0sec2000xgx5min2000xgx5min

(10)lxTE重懸感受態(tài)細(xì)胞x20

150mmx50150mmx3090mmx20鋪固體選擇培養(yǎng)基平板

注:*即為"構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞”

**在不同容積的無菌離心管中進(jìn)行，a:300或500ml;b:50ml;c:15ml;d:

文庫cDNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母感受態(tài)細(xì)胞

1.以生長于SD/-Ura,-His固體培養(yǎng)板上的含有構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA

及報告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作為宿主菌,制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。

2.將酵母宿主菌接種于SD/-Ura,-His液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入

SD/-Ura,-His液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr,至OD600〉。

SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基,115℃,10lb/in2滅菌15min

A.DifcoNitrogen

B.WW?

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xLeu

E.20xTrp

F.ddH2O-

3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD至OD600二約50ml),30℃恒溫250rpm

振蕩培養(yǎng)至OD600=約3hr).

YPD液體培養(yǎng)基,115℃,10lb/in2滅菌15min

A.Polypepton

B.bacto-YeastExtract

C.葡萄糖

D.ddH2O-300ml

4.室溫離心5000xgx5min，棄上清加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，

離心棄上清，沉淀用lxTE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)抱。

5.準(zhǔn)備下列試劑

lx轉(zhuǎn)化反應(yīng)10xTE10xLiAc50%PEGddH2O

II/800I100A.IxTE/LiAc100

I/I600B.PEG/LiAc600

C.lxTE//

6.取用IxTE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入下列成份,振蕩混勻。

Ig)40A.pB42AD-Library(50-100

B.lOmg/mlIHerringDNA*200

*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。匚

7.加入PEG/LiAc,振蕩混勻，30℃恒溫,250rpm振蕩培養(yǎng)30mino

I8,加入700DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min,迅速插入冰浴。

9.室溫離心2000xgx5min,盡量棄上清。

10.以100mm,每稀釋度各x2),30°(:倒置培養(yǎng)3-5天，確定轉(zhuǎn)化效率在2xl06cfu

以上有效。I稀釋不同倍數(shù)，涂布SD/-Ura,-His,-Trp固體培養(yǎng)板(IxTE重懸沉淀

細(xì)胞，取10

150mmx30),30℃倒置培養(yǎng)3-5天。I涂布SD/-Ura,-His,-Trp固體培養(yǎng)板

(11.按每板200

SD/-Ura,-His,-Trp固體培養(yǎng)基，115。。10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板

A.DifcoNitrogen

B.葡萄糖

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xLeu

E.Agar

F.ddH20150mm）一鋪30塊平板（

12.在超凈工作臺上，在所有生長菌落的平板上各加5mlTE緩沖液，將菌落刮下。

13.離心棄上清，加入10-20mlTE緩沖液重懸沉淀菌，加入等體積的無菌65%甘油

-MgSO4緩沖液，混勻，分裝管,保存于4℃1周或-8CTC1年以L

65%甘油-MgSO4緩沖液:65%甘油；100mMMgS04;25mMTris-HCI

A.甘油

B.MgSO4?7H2O

C.MTris-HCI

D.ddH20-

酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的篩選

1.經(jīng)過選擇培養(yǎng)基篩選的含有DNA-BD載體、文庫DNA及報告基因的酵母感受態(tài)

細(xì)胞，用無菌TE稀釋至1:104、1:106和1:108等不同濃度，

90mm）,30℃倒置培養(yǎng)3-5天，計數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。I,涂布SD/-Ura,-His,

-Trp固體培養(yǎng)板（2.取上述稀釋菌液各100

3.確定待進(jìn)一步鑒定的酵母菌滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)xl05（l:104稀釋）、克隆數(shù)

x107（1:106稀釋）或克隆數(shù)x109（1:108稀釋）。

4.按照以前實驗確定的文庫轉(zhuǎn)化效率的5?10倍的總量、xl06cfu/平板的菌量，涂布

SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。

5.挑取顯藍(lán)色的菌落,再接種于SD/-Ura,-His,-Trp固體培養(yǎng)基以及

SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以進(jìn)一步確證。

SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基

A.SD/Gal/Raf

B.10xDO（-His,-Leu,-Trp,-Ura）

C.Agar

D.ddH2O-

滅菌（115℃,10lb/in2）15min,冷卻至50℃,加入下列成份后鋪板

E.10xBU

F.20mg/mlX-gal90-100mm）鋪5-6塊平板（

lOxBU緩沖液，121℃,15lb/in2滅菌15min

A.Na2HPO4?12H2O

B.NaH2PO4*2H2O

C.ddH20一

20mg/mlX-Gal

A.X-Gal40mg

B.DMF2ml

酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定

-酵母質(zhì)粒DNA的提取

1.成娥經(jīng)過酵母選擇/誘導(dǎo)培養(yǎng)基初步鑒定的酵母單菌落，接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)

基，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)20"。

SD/-Trp液體培養(yǎng)基，115℃,10lb/in2滅菌15min

A.DifcoNitrogen

B.WH

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xHis

E.20xLeu

F.20xUra

G.ddH20-

2.室溫離心5000xgxlmin,棄上清，收菌。

I酵母裂解液，振蕩重懸沉淀酵母菌。3.加入200

酵母裂解液：2%TritonX-100;1%SDS;100mMNaCI;10mMTris-HCI;ImM

EDTA

A.10%TritonX-100

B.10%SDS

C.NaCI

D.Tris

E.EDTANa2-2H2O

F.HCI調(diào)

G.ddH20

4.加入下列試劑，充分振蕩5min;液氮凍存lOmin,室溫復(fù)融；再充分振蕩5mino

A.經(jīng)酸處理的玻璃珠(Sigma)

B.苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)

5.室溫離心12000xgxl0min,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入下列試劑，于

-70℃凍存30-60min。

A.3MNaAc(l/10IV)20

IB.無水乙醇500

6.離心12500xgxl0min,4℃,棄上清；70%乙醇洗滌沉淀，于37T烘箱或超凈

臺干燥DNA;將干燥的沉淀DNA重溶于I無菌ddH20中，保存于-20。匚20-30

酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定

-酵母質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化大腸桿菌

1.在冰浴條件下，取待轉(zhuǎn)化DNAI感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。g),加入100I

F,2002?將上述混合液加入間距的樣品杯中，電轉(zhuǎn)化，25a

3.迅速加入1ml新鮮的LB培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)入離心管中，37℃恒溫，150rpm振

蕩孵育30-60min。

4.將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布M9/D0(-Trp)固體培養(yǎng)板，37。(：倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)

(16-22hr)0

5.按常規(guī)方法擴(kuò)增上述陽性轉(zhuǎn)化菌，堿裂解法少量抽提質(zhì)粒DNA,酶切篩選AD載

體上含有插入片段的陽性克隆，保存其于25%甘油，待進(jìn)一步驗證。

M9/D0-Trp固體培養(yǎng)基，115℃,10lb/in2滅菌15min

A.葡萄糖

B.Agar

C.5xM9緩沖液60ml

D.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)30ml

E.20xHis15ml

F.20xLeu15ml

G.20xUra15ml

H.ddH2O165ml

冷卻至50℃左右，加入下列成份，混勻鋪板

I.Thiamine-HCIml

J.100mg/mlAmpml90-100mm）鋪10-15塊平板（

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（電轉(zhuǎn)化）

1.挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的KC8單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37P恒

溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）o

2.將ml新鮮菌液接種于500mlSOB培養(yǎng)液中，37。（：恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至

OD600;約。

SOB液體培養(yǎng)基，115℃,10lb/in2滅菌15min

A.bacto-Tryptone

B.bacto-YeastExtract

C.NaCI

D.KCI

E.MgCI2*6H2O

F.ddH20

3.將培養(yǎng)菌液收集于離心管中，冰水浴15-20min。

4.離心6000xgxl0min,4℃,棄盡上清；以5ml預(yù)冷的無菌ddH20重懸沉淀菌;

再加入500ml預(yù)冷的無菌ddH2O洗滌細(xì)菌。

5.重復(fù)_L述步驟1次，以充分去除培養(yǎng)基中殘余的鹽離子成份。

6.用40-50ml預(yù)冷的無菌10%甘油重懸沉淀細(xì)菌，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中；

離心6000xgxl0min,4℃,棄盡上清；重復(fù)此步驟1次。

7.以等體積(約預(yù)冷的無菌10%甘油重懸上述沉淀的感受態(tài)細(xì)胞，分裝管(5-6次轉(zhuǎn)

化反應(yīng))，保存于-8(TC備用。

酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的確證

1.以含有報告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作為轉(zhuǎn)化宿主菌。

2.將酵母宿主菌接種于SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入SD/-Ura

液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr,至OD600〉。

SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃,10lb/in2滅菌15min

A.DifcoNitrogen

B.

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xHis

E.20xLeu

F.20xTrp

G.ddH2O-

3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD至OD600;約50ml),30℃恒溫250rpm

振蕩培養(yǎng)至OD600=約3hr)。

YPD液體培養(yǎng)基，115℃,10lb/in2滅菌15min

A.Polypepton

B.bacto-YeastExtract

C.葡萄糖

D.ddH2O-300ml

4.室溫離心5000xgx5min，棄上清加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞,

離心點上清,沉浮用lxTE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

5.準(zhǔn)備下列試劑

20x轉(zhuǎn)化反應(yīng)lOxTElCxLiAc50%PEGddH20

I/I150A.lxTE/LiAc150

B.PEG/LiAc/

C.IxTE//

6.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。

A.pLexAIg)3-5orpLexA-X

Ig)3-5B.pB42AD-Y

C.lOmg/mlSpermIDNA*10

*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。匚

I用lxTE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞,振蕩混勻。7.每管加入100

各加入振蕩混勻，恒溫,振蕩培養(yǎng)

I8.600PEG/LiAc,30℃250rpm30mino

I9.各加入70DMSO韁和倒置混勻。42℃熱休克15min,迅速插入冰浴.

10.室溫離心13000xgxl0sec盡量棄上清以lxTE