CN117750943B 靶向動脈粥樣硬化脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)及其制備方法 （北京茵諾醫(yī)藥科技有限公司）

PCT/CN2021/1166812021.09.2024.01.18PCT/CN2022/1170912022.09.05WO2023/030524ZH2023.03.09A,2015.12.16A,2019.12.06A,2020.04.10A,2020.04.17靶向動脈粥樣硬化脂質(zhì)體納米載體遞送系本公開提供了一種主動包封脂質(zhì)體納米載脂質(zhì)體載體及其主動包封的用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)2統(tǒng)包括脂質(zhì)體載體及其主動包封的用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相所述動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病選自以下一種或多種：冠狀動脈粥樣硬所述用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的物質(zhì)選自以下所述脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)還包括靶向配體，其與脂質(zhì)體述靶向配體為透明質(zhì)酸鈉和DSPE_PEG2000_NH2通過酰胺鍵縮合形成3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體納米載體遞送系治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的物質(zhì)和所述脂質(zhì)體載體的質(zhì)量比為1:4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)，其特征在治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的物質(zhì)和所述脂質(zhì)體載體的質(zhì)量比為1：5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂質(zhì)體納米載體遞送系治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的物質(zhì)和所述脂質(zhì)體載體的質(zhì)量比為1：6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的脂質(zhì)體納米7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)體納米載體遞送系治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的物質(zhì)選自以下一種或多種：洛伐他汀、8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)，3治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)，其于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的物質(zhì)為瑞舒伐他汀，所述通過加入鹽溶液水化所述脂質(zhì)體載體并分離造成脂質(zhì)體內(nèi)外溶液酸度梯(2)向步驟(1)所得產(chǎn)物中加入造成脂質(zhì)體內(nèi)外溶液酸度梯度的鹽溶液對其進(jìn)行水化，(5)在步驟(4)所得到的脂質(zhì)體溶液加入待包被物質(zhì)溶液，孵育使藥物進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)426.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于，29.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于所述水化溫度為30～90℃。所述水化溫度為40～80℃。所述水化溫度為45～65℃。37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述濾膜孔徑為30nm、50nm、100nm、41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，步驟(5)中42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，步驟(5)中543.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，步驟(5)中48.一種藥物，其特征在于，所述藥物包含權(quán)利要求1至149.權(quán)利要求1至11中任一項所述的納米載體遞送系統(tǒng)、按照權(quán)利要求1所述的制備方法而制得的納米載體遞送系統(tǒng)、權(quán)利要求48所述的藥物在制備用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)其中，所述動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病選自以下一種或多種：化癥和動脈粥樣硬化性陽痿。53.權(quán)利要求1至11中任一項所述的納米載體遞送系統(tǒng)、按67斷或治療易損斑塊并持續(xù)釋放的靶向給藥系統(tǒng)，但是目前手段僅限于被動載藥方法。[0008]在靶向納米制劑領(lǐng)域，制劑粒徑和靶向配體偶聯(lián)密度對治療效果的影響密切相用特定納米結(jié)構(gòu)和特定配體密度進(jìn)行針對動脈粥樣硬化疾病的治統(tǒng)。所述脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體載體及其主動包封的用于預(yù)防和/或治療動8動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的物質(zhì)和所述脂質(zhì)體載體的質(zhì)量比為1:0.1~一步包括使用鹽溶液水化后的所述脂質(zhì)體載體主動包封所述用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣[0019]優(yōu)選地，所述用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的[0020]更優(yōu)選地，所述用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病[0024]本發(fā)明的第二方面提供了第一方面所述的脂質(zhì)體納米載包括通過加入鹽溶液水化所述脂質(zhì)體載體并分離造成脂質(zhì)體[0031](2)向步驟(1)所得產(chǎn)物中加入造成脂質(zhì)體內(nèi)外溶液酸度梯度的鹽溶液對其進(jìn)行9選為25～70℃的制備方法而制得的納米載體遞送系統(tǒng)、第三方面所述的藥物在制備用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的[0060]為了進(jìn)一步提升納米藥物遞送系統(tǒng)的治療效果，提高納米載體的載藥量和包封于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的物質(zhì)選自他汀類藥物、貝[0064]更優(yōu)選地，所述用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病[0067](2)向步驟(1)所得溶液或蒸干物中加入造成脂質(zhì)體內(nèi)外溶液酸度梯度的鹽溶液[0072]本發(fā)明提供了一種主動包封的脂質(zhì)體在制備用于動脈粥樣硬化或與動脈粥樣硬[0074]本發(fā)明提供了一種制備主動包封脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)的工藝路線及其優(yōu)化[0080]圖5例示靶向瑞舒伐他汀主動包封脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)HA@LP/RC的冷凍電鏡[0081]圖6例示靶向阿托伐他汀主動包封脂質(zhì)體HA_LP/AC冷凍電鏡和水合粒徑(Dynamic[0097]圖22例示本發(fā)明的HA_LP/R納米藥物遞送系統(tǒng)與各對照組的斑塊體積進(jìn)展百分LP/RC納米載體遞送系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)吞實驗活細(xì)胞檢測熒光顯微鏡照片；藍(lán)色為Hoechst33342[0120]在本實施例中，以平均分子量為1.2_1.6萬的透明質(zhì)酸鈉(HA)和DSPE_PEG2000_[0121]具體方法為稱取HA75g用純化水或注射用水?dāng)嚢枞芙狻＜尤隓PN鈣溶液中使脂材溶液充分水化，形成粗脂質(zhì)體懸浮[0128]在本實施例中，采用混合水化&主動包封法制備瑞舒伐他汀的納米脂質(zhì)體。稱取(150mM或大于150mM)在40_60℃保溫條件下采用三通管、微流控等其他混合器按恒比例混出3次以上。擠出后的脂質(zhì)體溶液采用純化水稀釋20倍及以上，通過控制膜孔徑和擠出次伐他汀鈣溶液或瑞舒伐他汀鈣和蔗糖的混合溶液混勻小于0.25)，于4_66℃條件下孵育15分鐘或以上，得到主動包封瑞舒伐他汀鈣的納米脂質(zhì)體。所制備的納米脂質(zhì)體對API的包封率大于80最終制劑中API的濃度小于等于20mg/[0129]從圖3中可以看出，本實施例中混合水化主動包封瑞舒伐他汀的納米脂質(zhì)體LP/[0131]如上述實施例1所制備的靶向材料HPD插入實施例2所制備的150nm載藥納米脂質(zhì)汀鈣的納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵HPD濃度為200±31μg/mL的高濃度靶[0133]試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預(yù)先包被透明質(zhì)酸衍生物(HA)在45℃的恒溫水浴鍋中使脂膜充分水化，形成粗制脂質(zhì)體懸浮液。使用擠出儀分別經(jīng)過[0137]制備的瑞舒伐他汀鈣納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HA水溶液混合加入偶聯(lián)劑EDC和NHSS，在25℃或大于25℃保溫條件下膜包透析分離未偶聯(lián)的HA，得到最終產(chǎn)品中HA濃度為10_200μg/mL的靶向載藥脂質(zhì)體HA@CC[0141]制備的載阿托伐他汀鈣的納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未[0142]從圖6中，可以看到本實施例中靶向阿托伐他汀主動包封脂質(zhì)體HA_LP/AC冷凍電離未包封的醋酸鈣，收集內(nèi)液，取2mL與1mL阿司匹林水溶液混勻后，于40℃條件下孵育[0145]制備的載阿司匹林納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的[0146]圖7顯示了本實施例中靶向阿司匹林主動包封藥物脂質(zhì)體HA_LP/AspC冷凍電鏡和[0150]制備的載匹伐他汀納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的離未包封的醋酸鈣，收集內(nèi)液，取2mL與1mL洛伐他汀水溶液混勻后，于65℃條件下孵育[0154]制備的載洛伐他汀納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的溶液(Simv,1mg/mL)用NaOH調(diào)節(jié)pH并加入10％的2_羥基丙基_β_環(huán)糊精使其溶解。稱取[0158]制備的載辛伐他汀納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的溶液(Pravas,1mg/mL)。稱取DSPC、膽固醇、聚乙二醇_二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE_[0162]制備的載普伐他汀納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的液(Beza,1mg/mL)用NaOH調(diào)節(jié)pH并[0166]制備的苯扎貝特納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的[0170]制備的環(huán)丙貝特納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的[0174]制備的阿西美辛納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的(Ozagrel,2mg/mL)加入10％的2_羥基丙基_β_環(huán)糊精使其溶解。稱取二硬脂酰磷脂酰膽堿[0178]制備的奧扎格雷納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的[0181]在本實施例中，采用乙醇注入、主動包封、后插入法制LP/TC。替羅非班水溶液(Tirofiban,2mg/mL)加入10％的2_羥基丙基_β_環(huán)糊精使其溶解。稱取二硬脂酰磷脂酰膽[0182]制備的替羅非班納米脂質(zhì)體溶液和預(yù)先溶解好的HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育5分鐘以上，孵育結(jié)束后使用透析袋或超濾膜包透析分離未插入的[0184]實施例17靶向的瑞舒伐他汀主動包封脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)(HA@LP/Rd)的制備[0185]稱取氫化大豆磷脂酰膽堿、DPN、膽固醇、聚乙二醇_二硬脂?；字Ｒ掖及吩?，90r/min，30min)除去有機(jī)溶劑，從而在容器壁上形成脂膜。加葡萄糖酸銅水溶液[0186]HA水溶液混合加入偶聯(lián)劑EDC和NHS得到最終產(chǎn)品中HA濃度為10_200μg/m[0187]圖17顯示了本實施例中靶向瑞舒伐他汀主動包封脂質(zhì)體HA@LP/Rd冷凍電鏡和[0188]實施例18靶向的阿托伐他汀主動包封脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)(HA@LP/Ad)的制備[0189]稱取二棕櫚酰磷脂酰膽堿、DPN、膽固醇、聚乙二醇_二硬脂?；字Ｒ掖及?5℃的恒溫水浴鍋中使脂膜充分水化，形成粗制脂質(zhì)體懸浮液。使用擠出儀分別經(jīng)過[0190]HA水溶液混合加入偶聯(lián)劑EDC和NHS得到最終產(chǎn)品中HA濃度為10_200μg/m[0191]圖18顯示了本實施例中靶向阿托伐他汀主動包封脂質(zhì)體HA@LP/Ad冷凍電鏡和[0194]由實施例1所制備HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育30分鐘以200μg/mL的高濃度靶向配體脂質(zhì)體得到最終產(chǎn)品中HA濃度為10_200μg/mL的靶向載藥脂質(zhì)檸檬酸鎂水溶液中使脂材溶液充分水化，形上，得到主動包封苯扎貝特的納米脂質(zhì)體。所制[0199]由實施例1所制備HPD水溶液混合，在25℃或大于25℃保溫條件下孵育30分鐘以200μg/mL的高濃度靶向配體脂質(zhì)體得到最終產(chǎn)品中HA濃度為10_200μg/mL的靶向載藥脂質(zhì)[0209]試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預(yù)先包被透明質(zhì)酸衍生物(HA)[0211]參考標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖29所示，擬合方程:y＝(A一D)/[1+(x/C)^B]+D其中：A=[0213]取一定量納米載體，HPLC法測游離藥物和總藥物量，并通過以下公式1計算包封[0221]本試驗例的目的是驗證本發(fā)明所述的靶向脂質(zhì)體納米藥物載體遞送系統(tǒng)，例如[0231]操作步驟參照本平臺細(xì)胞復(fù)蘇操作流程，培養(yǎng)基用本平臺常規(guī)THP1細(xì)胞培養(yǎng)基的Hoechst33342溶液，并把稀釋好的Hoechst33342溶液和細(xì)胞孵育10min進(jìn)行細(xì)胞核的染入100μlRIPA細(xì)胞裂解液，采用熒光讀板儀檢測孔板中熒光強(qiáng)度。獲得的試驗數(shù)據(jù)使用[0235]細(xì)胞內(nèi)吞實驗比較了LPS刺激后的THP1細(xì)胞對于HA@LP/RC和LP/R[0238]本試驗例的目的是初步揭示本發(fā)明所述的靶向脂質(zhì)體納米藥物載體遞送系統(tǒng)在動物體內(nèi)的分布和代謝情況。本試驗將試驗例2中細(xì)胞內(nèi)吞實驗的HA@LP/RC和LP/RC脂質(zhì)體型。靶向納米他汀制劑(HA@LP/RC[0245]試驗例4本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體納米載體遞送系統(tǒng)對動脈粥樣硬化的影響的體內(nèi)實驗[0246]本試驗例的目的是驗證本發(fā)明所述的靶向脂質(zhì)體納米藥物載體遞送系統(tǒng)，例如[0255]瑞舒伐他汀靜脈注射組：以0.66mg[0259]圖22和23示出了本發(fā)明所述的HAM_LP/RA150載體遞送系統(tǒng)對動脈粥樣硬化的體內(nèi)的主動脈富集功能，相比較于非靶向遞送體系(LP/RA150)，這種富集效應(yīng)在靶向納米制劑成