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DB34DB34/T3208—2018羊傳染性膿瘡病毒分離鑒定技術規程TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofGoatContagiousEcthymaVirus2018-10-20發布2018-11-20實施安徽省質量技術監督局發布I心1NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技增殖表皮癌細胞（HeLa）、羊睪丸原代細胞（Lambtestiscells，LT）、DMEM培養基、M199液溫融解，反復三次。經5000r/min離心10min，取上清，并加入青霉素和鏈霉素，終濃度為20002養液，用滅菌PBS清洗三次，接種1mL處理好的樣品，于5%CO?培養箱，37℃下吸附2h,期間每隔30min輕輕搖晃一次。棄去樣品液，用滅菌PBS清洗三次，加入5mL細胞維持液(血清含量為2%),培養箱內繼續培養5d。在培養過程中每日觀察細胞病變(CPE)產生情況，如出現CPE(特征病變為：細胞間隙增大、細胞核固縮、細胞圓化脫落),收集細胞培養上清及細胞裂解液。同時設立空白對照(見圖1)。5.2.1原代細胞制作選擇2～3月齡健康雄性綿羊，無菌摘取睪丸，并浸泡于含雙抗的M199培養基中保存，將睪丸組織放入平皿中，剝棄髓鞘及白膜，除去脂肪層，用含雙抗的滅菌PBS清洗2～3次，放入燒杯中將睪按組織量的4倍加入胰酶消化液，37℃消化30min,至睪丸組織呈蓬松狀，加入M199培養液清洗，將胰酶消化液徹底沖洗干凈，加入適量生長液(含10%血清的M199培養基),用玻璃珠振蕩法分散細胞，6層紗布進行過濾，取濾液進行細胞計數，用生長液將細胞密度調整為100～150萬個/mL的細胞懸液，7mL/瓶(T25細胞培養瓶),置37℃、5%CO?培養箱中進行培養。用滅菌PBS清洗三次，接種1mL處理好的樣品，于5%CO?培養箱，37℃下吸附1h,期間每隔15min輕輕搖晃一次。吸附完成后，棄去樣品液，用滅菌PBS清洗三次，加入5mL細胞維持液(血清含量為2%),培養箱內繼續培養4d。在培養過程中每日觀察CPE產生情況，如出現CPE,收集細胞培同時設立空白對照(見圖2)。3A:病變的羊睪丸原代細胞；B:對照細胞性條帶(見圖3)

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