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DB34DB34/T3307—2018Protocolformolecularmarkerassisted-selectionofriceblastresistancegenePi1andPi2PCRmethod2018-12-29發布2019-01-29實施安徽省市場監督管理局發布I1GB/T6682分析實驗室用水規CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，DNA：deoxyribonucleicaciddNTPs：deoxyribonucleosidetriphoPAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚PCR：polymerasechainreaction，聚合SSR：simplesequencere的DNA，利用篩選的特異性檢測引物對樣品DNA進行PCR擴增，依據是否擴增獲得預期大小的DNA2高壓滅菌鍋、超純水儀、高速離心機、恒溫水浴鍋（30℃~100℃)、核酸蛋白測定儀、組織研磨去離子甲酰胺、溴酚藍、二甲苯青FF、丙烯酰胺、取待檢樣品的去殼種子、幼苗或葉片約200～300mg置于2.0mL離心管，充分研磨；每管700μL經65℃預熱的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30mi棄上清液，用70％乙醇溶液洗滌2遍；室溫自然晾干后，加入超純水或T將種子發芽至幼苗長度達到3cm左右時剪取0.5cm長的幼苗，或將田間植株的葉片剪取0.53擴增產物加入2L上樣指示劑后于4℃保存。涂有剝離硅烷的一面朝下蓋于無凹槽玻璃板上，兩側對稱拔下玻璃板上的樣品梳，用清水洗凈點樣槽，再將玻璃板裝上電泳槽，上下槽4針對連鎖標記兩重PCR擴增產物的檢測，若樣本量大（多于96個樣品），進行兩道電泳，即每斷開電源，第二次點樣96個（包括兩個對照樣品），2000出，在清水中漂洗1分鐘左右；最后取出膠板，晾干，放在膠片觀察燈下觀察，長度的PCR擴增產物，則可判斷檢測樣品中不含有相應的抗稻瘟病基因；如可擴增出與陽性對照5用TE緩沖液1（或超純水）分別配制正向A.3.140％PAGE膠6A.3.24％PAGE膠A.3.3親和硅烷工作液A.3.55×TBE緩沖液A.3.60.5×TBE緩沖液7原濃度終濃度體積ddH2O--10×Buffer10×1×1MgCl225mmol/L2.5mmol/L1dNTP2.5mmol/L0.2mmol/LTaq酶5U/L0.5UP1-1引物5mol/L0.25mol/LP2-1引物5mol/L0.25mol/LDNA2原濃度終濃度體積ddH2O--10×Buffer10×1×1MgCl225mmol/L2.5mmol/L1

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