枸杞干果中苦參堿和氧化苦參堿殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法

枸杞干果中苦參堿和氧化苦參堿殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法1范圍本規程規定了枸杞干果中苦參堿（matrine）和氧化苦參堿（oxymatrine）殘留量的液相色譜-串聯質譜測定方法。本規程適用于枸杞干果中苦參堿和氧化苦參堿殘留量的定性鑒別和定量測定，其中苦參堿方法檢出限為0.002mg/kg，定量限為0.005mg/kg；氧化苦參堿方法檢出限為0.003mg/kg，定量限為0.01mg/kg。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改單）適用于本文件。GB2763食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量GB2760食品安全國家標準食品添加劑使用標準GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T27404實驗室質量控制規范食品理化檢測NY/T761蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定GB/T8855新鮮水果和蔬菜取樣方法3原理試樣中的苦參堿和氧化苦參堿經甲醇-鹽酸溶液提取，固相萃取柱凈化去除基質干擾后，采用液相色譜-串聯質譜儀進行分離和檢測，外標法定量。利用兩種化合物各自的保留時間和特征離子對進行定性鑒別，根據峰面積與濃度的線性關系，分別計算兩者的殘留量。苦參堿與氧化苦參堿基本信息：①苦參堿：分子式C15H24N2O，分子量248.36，CAS號519-02-8；②氧化苦參堿：分子式C15H24N2O2，分子量264.36，CAS號16837-52-8。兩者均具有特定的母離子和子離子特征，可通過優化質譜條件實現精準分離與檢測，有效規避基質干擾。4試劑與材料除非另有說明，所用試劑均為分析純或色譜純，實驗用水符合GB/T6682中一級水的規定。4.1試劑甲醇（CH3OH）：色譜純。乙腈（CH3CN）：色譜純。鹽酸（HCl）：分析純，濃度36%-38%。氨水（NH3·H2O）：分析純，濃度25%-28%。氯化鈉（NaCl）：分析純，60℃烘干2h，冷卻后備用。無水硫酸鎂（MgSO4）：分析純，60℃烘干4h，冷卻后備用。苦參堿標準品：純度≥98.0%，編號、生產廠家及有效期清晰可追溯。氧化苦參堿標準品：純度≥98.0%，編號、生產廠家及有效期清晰可追溯。鹽酸-甲醇溶液（0.1+99.9，v/v）：量取0.1mL鹽酸，緩慢加入99.9mL甲醇中，混勻備用，現配現用。氨水-甲醇溶液（5+95，v/v）：量取5mL氨水，加入95mL甲醇中，混勻備用，密封保存。甲醇-水溶液（40+60，v/v）：量取40mL甲醇，加入60mL一級水，混勻備用。4.2標準溶液配制單標儲備液（1000μg/mL）：分別準確稱取0.0100g苦參堿、氧化苦參堿標準品，各自置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，置于-18℃冰箱中避光保存，有效期6個月。混合標準中間液（10μg/mL）：準確吸取1.00mL苦參堿、1.00mL氧化苦參堿單標儲備液，共同置于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，置于4℃冰箱中避光保存，有效期1個月。混合標準工作液：準確吸取適量混合標準中間液，用甲醇-水溶液（40+60，v/v）逐級稀釋成濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20μg/mL的混合標準工作液（其中苦參堿濃度涵蓋自身定量限，氧化苦參堿濃度同步匹配），現配現用。4.3材料與耗材固相萃取柱：MCX柱（60mg/3mL）或同等性能陽離子交換固相萃取柱，使用前用5mL甲醇和5mL一級水活化。離心管：50mL，聚四氟乙烯材質，耐有機溶劑和酸性試劑。濾膜：0.22μm，有機相針式濾器。研磨機：高速組織研磨機，轉速可調節，避免樣品發熱。離心管：10mL，刻度離心管，耐有機溶劑。移液槍頭：1mL、5mL，無酶無雜質，適配移液器。5儀器與設備液相色譜-串聯質譜儀（LC-MS/MS）：配備電噴霧離子源（ESI）。高速冷凍離心機：轉速≥8000r/min，溫度可調控（0-40℃）。高速組織研磨機：轉速≥20000r/min，可配備低溫研磨功能。電子天平：精度0.1mg（用于標準品稱量）和0.001g（用于試樣稱量）。超聲波清洗器：功率≥200W，頻率40kHz，可調控溫度。氮吹儀：可控溫（室溫-80℃），氮氣純度≥99.99%，氣流可調節。移液器：1mL、5mL、10mL，精度符合A級要求，定期校準。容量瓶：10mL、50mL、100mL，玻璃材質，校準合格，無破損。渦旋振蕩器：轉速可調節（0-3000r/min），振蕩均勻無滲漏。烘箱：可調控溫度（室溫-200℃），用于試劑烘干和耗材干燥。固相萃取裝置：負壓可調節（0-0.1MPa），可同時處理多根固相萃取柱。6試樣制備與保存6.1試樣制備取樣：按照GB/T8855的規定，隨機抽取代表性枸杞干果試樣，取樣量不少于1kg，去除雜質、破損粒和霉變粒，充分混勻。粉碎：將混勻后的試樣放入高速組織研磨機中，粉碎至均勻粉末（過40目篩），粉碎過程中避免樣品發熱導致苦參堿、氧化苦參堿降解，粉碎后立即裝入潔凈的密封容器中，做好標記（注明試樣名稱、取樣日期、制備日期）。分樣：將粉碎后的試樣分成兩份，一份用于檢測，一份作為留樣，留樣量不少于200g，密封保存。6.2試樣保存制備好的試樣應置于4℃冰箱中避光保存，檢測試樣應在24h內完成提取，避免長時間存放導致目標物降解；留樣保存期不少于6個月，保存過程中應防止樣品受潮、污染和目標物殘留降解，留樣容器應密封完好，標簽信息完整。7分析步驟7.1提取準確稱取5.00g（精確至0.001g）粉碎后的枸杞干果試樣，置于50mL離心管中，加入20mL鹽酸-甲醇溶液（0.1+99.9，v/v），渦旋振蕩5min，使試樣充分浸潤，避免試樣結塊。將離心管放入超聲波清洗器中，超聲提取20min（溫度控制在25±2℃），期間每隔5min渦旋振蕩1次，確保苦參堿和氧化苦參堿充分提取。提取完成后，加入3g氯化鈉和5g無水硫酸鎂，立即渦旋振蕩3min，充分混勻，靜置10min，使水相和有機相分層，便于后續離心分離。將離心管放入高速冷凍離心機中，8000r/min、4℃條件下離心10min，吸取上清液10mL，置于另一干凈的50mL離心管中，待凈化；若上清液渾濁，可再次離心后吸取上清液。7.2凈化將活化后的MCX固相萃取柱連接至固相萃取裝置，調節負壓至0.03-0.05MPa，將待凈化的上清液緩慢注入固相萃取柱中，控制流速為1-2mL/min，棄去流出液。用5mL一級水沖洗固相萃取柱，控制流速為1-2mL/min，棄去沖洗液；再用5mL甲醇沖洗固相萃取柱，棄去沖洗液，并用氮吹儀將柱內殘留液體吹干（氮氣流速不宜過大，避免吹干固相萃取柱填料，影響洗脫效果）。用5mL氨水-甲醇溶液（5+95，v/v）洗脫固相萃取柱，控制流速為1-2mL/min，將洗脫液收集于10mL刻度離心管中，洗脫過程中確保洗脫液完全收集，無遺漏。將洗脫液置于氮吹儀中，40℃水浴加熱，氮吹至近干（剩余約0.1mL），避免氮吹過度導致目標物損失，加入1.00mL甲醇-水溶液（40+60，v/v），渦旋振蕩1min，充分溶解殘渣。將溶解后的溶液過0.22μm有機相濾膜，去除微小雜質，濾液置于進樣瓶中，供液相色譜-串聯質譜儀檢測。7.3空白實驗除不加入試樣外，其余均按照7.1和7.2的步驟操作，制備空白試樣溶液，供檢測使用，用于扣除空白干擾；空白實驗應與試樣檢測同步進行，確保實驗條件一致。7.4加標回收實驗取已知不含苦參堿和氧化苦參堿的枸杞干果試樣，分別加入低、中、高三個濃度的混合標準工作液，加標濃度如下：低濃度（苦參堿0.005mg/kg、氧化苦參堿0.01mg/kg，均為各自定量限）、中濃度（苦參堿0.05mg/kg、氧化苦參堿0.05mg/kg）、高濃度（苦參堿0.20mg/kg、氧化苦參堿0.20mg/kg），每個濃度做3個平行樣，按照7.1和7.2的步驟操作，計算加標回收率，驗證方法的準確性和可靠性。8液相色譜-串聯質譜條件8.1液相色譜條件色譜柱：C18色譜柱（100mm×2.1mm，1.8μm）或同等性能反相色譜柱，耐酸性流動相。柱溫：30℃，保持恒定，避免溫度波動影響分離效果。流動相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸水溶液（v/v），梯度洗脫程序見表1，確保苦參堿與氧化苦參堿完全分離，且與基質雜質有效區分。流速：0.3mL/min，恒定流速，避免流速波動導致峰形畸變。進樣量：5μL，進樣前確保進樣瓶潔凈、無氣泡。運行時間：12min，確保所有目標物和雜質均能流出。進樣方式：自動進樣，進樣針清洗程序為甲醇-水（1:1，v/v）清洗3次，避免交叉污染。時間（min）甲醇（A相，%）0.1%甲酸水溶液（B相，%）0.040604.070308.070308.1406012.04060表1梯度洗脫程序8.2質譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式（ESI+），離子源噴霧穩定。掃描方式：多反應監測（MRM），針對苦參堿和氧化苦參堿分別設置特征離子對監測通道。電離電壓（IS）：3200V，根據儀器靈敏度適當調整。霧化氣壓力（GS1）：344.7kPa（50psi）。氣簾氣壓力（CUR）：137.9kPa（20psi），用于去除雜質離子，提高檢測靈敏度。輔助氣壓力（GS2）：344.7kPa（50psi），輔助霧化，增強離子化效率。離子源溫度（TEM）：450℃，避免溫度過高導致目標物分解。碰撞氣：氬氣，純度≥99.99%，碰撞氣壓力根據儀器要求調整（通常為0.2-0.3MPa）。苦參堿和氧化苦參堿的特征離子對及質譜參數見表2，其中每種化合物選取2對特征離子對，響應值最高的為定量離子對，另一對為定性離子對。化合物名稱母離子（m/z）子離子（m/z）去簇電壓（DP，V）碰撞能量（CE，eV）離子類型備注苦參堿249.2148.17022碎片離子定量離子對苦參堿249.2134.17028碎片離子定性離子對氧化苦參堿265.2134.17524碎片離子定量離子對氧化苦參堿265.2148.17530碎片離子定性離子對表2苦參堿和氧化苦參堿的MRM監測參數9定性與定量分析9.1定性鑒別在相同的色譜和質譜條件下，試樣溶液中出現的色譜峰保留時間，與混合標準工作液中苦參堿、氧化苦參堿的保留時間偏差應在±2.5%以內。對于試樣溶液中檢出的苦參堿、氧化苦參堿，其各自的兩對特征離子對（定量離子對和定性離子對）的峰面積比，與混合標準工作液中對應化合物的離子對峰面積比偏差應在±15%以內。空白試樣溶液中，在苦參堿和氧化苦參堿的保留時間窗口內，不得出現與混合標準工作液中對應的特征離子峰；若出現，應排查試劑、耗材、儀器等環節的污染，重新處理試樣并檢測。只有同時滿足上述兩項要求，方可定性判定試樣中檢出對應化合物。9.2定量分析分別以混合標準工作液中苦參堿、氧化苦參堿的濃度（μg/mL）為橫坐標（x），對應定量離子對的峰面積為縱坐標（y），繪制兩種化合物各自的標準工作曲線，計算回歸方程和相關系數（r）。要求兩種化合物的相關系數r均≥0.998，確保線性關系良好。根據試樣溶液中苦參堿、氧化苦參堿定量離子對的峰面積，分別代入各自的回歸方程，計算出試樣溶液中兩種化合物的濃度（μg/mL）。按公式（1）分別計算枸杞干果中苦參堿和氧化苦參堿的殘留量：X=式中：X——試樣中苦參堿（或氧化苦參堿）的殘留量，單位為毫克每千克（mg/kg）；C——由標準工作曲線計算得到的試樣溶液中苦參堿（或氧化苦參堿）的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；C0——空白試樣溶液中苦參堿（或氧化苦參堿）的濃度（若有），單位為微克每毫升（μg/mL）；V——試樣溶液的最終定容體積，單位為毫升（mL）（本規程中V=1.00mL）；f——試樣的稀釋倍數（本規程中f=1）；m——稱取試樣的質量，單位為克（g）（本規程中m=5.00g）；1000——單位換算系數（將微克每毫升換算為毫克每千克）。計算結果保留三位有效數字，當殘留量低于對應化合物的定量限時，報告為“未檢出（<定量限）”，例如：苦參堿未檢出（<0.005mg/kg）、氧化苦參堿未檢出（<0.01mg/kg）。10精密度與準確度10.1精密度同一實驗室，由同一操作人員使用同一臺儀器，對同一枸杞干果試樣（含低、中、高三個濃度，分別對應兩種化合物的加標濃度）進行6次平行測定，測定結果的相對標準偏差（RSD）應滿足：低濃度（定量限水平）：苦參堿RSD≤20%，氧化苦參堿RSD≤20%；中、高濃度：苦參堿RSD≤15%，氧化苦參堿RSD≤15%。10.2準確度低、中、高三個濃度的加標回收率應滿足：苦參堿加標回收率在70%-110%之間，氧化苦參堿加標回收率在70%-110%之間；每個濃度3個平行樣的回收率相對標準偏差（RSD）≤15%。11檢出限與定量限本方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）基于空白試樣加標實驗確定：苦參堿：檢出限（LOD）為0.002mg/kg，定量限（LOQ）為0.005mg/kg；氧化苦參堿：檢出限（LOD）為0.003mg/kg，定量限（LOQ）為0.01mg/kg。檢出限定義為空白試樣中，信噪比（S/N）=3時對應的化合物濃度；定量限定義為空白試樣中，信噪比（S/N）=10時對應的化合物濃度，且該濃度下的加標回收率和精密度符合本規程10章的要求。12質量控制與質量保證12.1試劑與標準品控制所有試劑均應符合本規程規定的純度要求，實驗前應對試劑進行空白驗證，確保無苦參堿、氧化苦參堿干擾。標準品應從正規渠道采購，純度≥98.0%，使用前核對標準品的編號、純度和有效期，標準溶液配制應嚴格按照操作規程進行，做好配制記錄（注明配制日期、人員、濃度等信息）。標準工作曲線應每次實驗重新繪制，若標準工作曲線的相關系數r<0.998，應檢查試劑、儀器條件或操作步驟，重新配制標準工作液并繪制曲線。鹽酸-甲醇溶液、氨水-甲醇溶液等易揮發試劑，應現配現用或密封保存，避免濃度變化影響實驗結果。12.2儀器控制液相色譜-串聯質譜儀應定期校準，包括色譜柱分離效率、質譜儀靈敏度、離子源穩定性、質量軸準確性等，校準記錄應完整可追溯，校準周期不超過1年。實驗前應檢查儀器的流動相、氮氣、氬氣（碰撞氣）壓力，確保儀器正常運行；實驗后應按照儀器操作規程，對色譜柱、離子源、進樣系統等進行清洗，延長儀器使用壽命。離心計、電子天平、移液器等儀器，應定期檢定或校準，確保精度符合要求；超聲波清洗器、氮吹儀等設備，應定期檢查運行狀態，確保參數穩定。12.3實驗過程控制每批試樣（不超過20個）應至少設置1個空白試樣、1個加標試樣（中濃度，同時包含苦參堿和氧化苦參堿），用于監控實驗過程中的干擾和回收率。空白試樣中不得檢出苦參堿和氧化苦參堿，若檢出，應排查試劑、耗材、儀器等環節的污染，重新處理試樣。加標試樣的回收率應在70%-110%之間，若回收率超出范圍，應重新進行實驗，查找原因（如提取不充分、凈化效果不佳、儀器參數異常等）并糾正。每個試樣應做2個平行樣，平行樣測定結果的相對標準偏差應符合本規程10.1的要求，若超出范圍，應重新測定該試樣。實驗過程中應做好詳細記錄，包括試樣信息、試劑使用、儀器參數、實驗步驟、測定結果等，確保實驗過程可追溯。12.4留樣控制留樣應妥善保存，標簽信息完整（包括試樣名稱、來源、取樣日期、制備日期、檢測日期、留樣人等），保存期不少于6個月，便于后續復檢和追溯；留樣應置于4℃冰箱中避光保存，避免目標物降解。13安全與環保要求13.1安全要求實驗過程中使用的甲醇、乙腈等有機溶劑具有揮發性和毒性，鹽酸、氨水具有腐蝕性，應在通風櫥內操作，操作人員應穿戴防護服、耐酸堿手套、防護口罩和護目鏡，避免直接接觸皮膚、黏膜和吸入蒸汽。苦參堿、氧化苦參堿標準品具有一定毒性，稱量時應在通風櫥內進行，避免灑落，稱量后的廢液和廢渣應妥善處理，不得隨意丟棄。實驗儀器應按照操作規程操作，避免違規操作導致儀器損壞或人員受傷；離心操作時，應確保離心管平衡，防止離心管破裂；超聲波清洗器操作時，避免打開蓋子近距離接觸超聲區域。實驗室應配備消防器材、急救藥品（如中和劑、消毒棉、碘伏等），操作人員應熟悉消防器材和急救藥品的使用方法；若發生試劑接觸皮膚或誤食，應立即采取急救措施并就醫。13.2環保要求實驗過程中產生的廢液（如提取液、洗脫液、標準溶液廢液、鹽酸-甲醇溶液廢液等），應收集于專用的廢液容器中，分類存放（酸性廢液、有機廢液分開存放），委托有資質的單位進行無害化處理，不得直接排放。實驗用過的濾膜、固相萃取柱、離心管等耗材，應分類收集，進行無害化處理后丟棄，避免污染環境；廢棄的標準品包裝應妥善回收，不得隨意丟棄。實驗過程中應節約用水、用電，減少試劑浪費，踐行綠色實驗理念；試劑瓶應密封保存，避免試劑揮發污染環境。14實驗報告實驗報告應完整、準確、清晰，至少包含以下內容：報告標題：枸杞干果中苦參堿和氧化苦參堿殘留量的測定報告。試樣信息：試樣名稱、來源、取樣日期、制備日期、留樣量、試樣狀態等。實驗依據：本規程編號及名稱。試劑與儀器：試劑名稱、純度、生產廠家；儀器名稱、型號、校準情況、使用參數。實驗步驟：簡要描述試樣提取、凈化、檢測的關鍵步驟，以及液相色譜-串聯質譜條件。實驗結果：標準工作曲線（回歸方程、相關系數）、空白實驗結果、試樣測定結果（苦參堿和氧化苦參堿殘留量、平行樣偏差）、加標回收率結果、精密度結果等。定性與定量結論：明確試樣中苦參堿和氧化苦參堿殘留量是否符合GB2763的規定，若超出限量，應注明超標情況。異常情況：實驗過程中出現的異常情況（如儀器故障、試劑污染、回收率異常等）及處理方法、處理結果。實驗人員、審核人員、批準人員簽字及日期。15附錄附錄A常見干擾及排除方法基質干擾：枸杞干果中含有糖類、色素、有機酸等基質成分，可能對檢測產生干擾，表現為空白試樣中出現雜峰、目標物峰形畸變或響應值異常。排除方法：優化MCX固相萃取柱的凈化條件，增加沖洗液體積（如將一級水沖洗體積增至8mL）；調整梯度洗脫程序，延長目標物與雜質的分離時間；選用更高純度的試劑，減少試劑中的雜質干擾；采用基質匹配標準曲線進行定量，減少基質效應的影響。離子抑制/增強效應：質譜檢測過程中，基質成分可能導致苦參堿、氧化苦參堿的離子化效率降低（離子抑制）或升高（離子增強），影響定量準確性。排除方法：優化質譜參數（如去簇電壓、碰撞能量），提高目標物的離子響應；采用基質匹配標準曲線代替溶劑標準曲線進行定量，有效校正基質效應；優化凈化步驟，去除更多基質雜質。試劑污染：試劑中含有微量苦參堿、氧化苦參堿，導致空白試樣檢出。排除方法：更換試劑批次，選用更高純度的色譜純試劑；對所有試劑進行空白驗證，合格后方可使用；實驗所用耗材（離心管、濾膜等）應提前用甲醇浸泡清洗，晾干后使用，避免耗材污染。目標物降解：實驗過程中苦參堿、氧化苦參堿發生降解，導致測定結果偏低。排除方法：試樣制備后及時提取，避免長時間存放；