質粒DNA的小量制備

基因工程實驗模塊一、質粒DNA的提取和鑒定二、目的基因的獲得和重組載體的構建三、感受態細胞的制備、轉化及重組子篩選四、目的基因在E.coli中表達與SDS鑒定一、質粒DNA的提取和鑒定實驗一、質粒DNA的小量制備實驗二、質粒DNA的電泳鑒定實驗三、質粒DNA的酶切質粒(plasmid)的基本概念：1）是生物細胞內固有的、能獨立于染色體而自主復制、并被穩定遺傳的核酸分子。2）存在于細菌、真菌、藍藻、酵母等細胞中。背景知識復習4）絕大多數的天然DNA質粒具有共價、閉合、環狀的雙鏈結構(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)，以超螺旋形式存在。3）絕大多數質粒是DNA型的，但酵母的“殺傷質粒”是RNA。5）分子大小：1-300kb。質粒的基本特征：自主復制性不相容性可轉移性

攜帶特殊的遺傳標記嚴緊型質粒松弛型質粒

根據在每個細胞中的分子數(拷貝數)多寡，質粒可分為：

質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統，進行自主復制。自主復制性：

1-3拷貝/cell，復制受細胞核控制，伴隨染色體DNA復制而復制。如：pSC101、p15A。1）嚴緊型質粒(stringentplasmid)：

加入氯霉素（終濃度10-170g/ml）抑制細菌蛋白質合成后，可達3000拷貝/cell。2）松弛型質粒(relaxedplasmid)：如：pMB1、ColE1。10-200拷貝/cell，復制不受細胞核控制，染色體DNA復制停止時，仍可進行復制。質粒DNA的提取方法：氯化銫密度梯度離心法堿裂解法沸水浴法氯化銫密度梯度離心法：

質粒純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染；堿裂解法：

質粒純度低、快速、操作簡便；沸水浴法：質粒純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間。

在強堿性溶液中，DNA雙鏈的氫鍵斷裂變性；當溶液恢復中性時，DNA雙鏈復性。原理：堿裂解法是最常用的質粒DNA提取方法。12在變性后雙鏈不分離、復性快。閉合環狀的質粒DNA：13強堿性

變性后雙鏈分離、難以復性而形成纏繞結構，與蛋白質-SDS復合物結合在一起，離心時沉淀。染色體線性DNA、有缺口的質粒DNA：14本實驗的目的掌握質粒DNA提取的堿裂解方法。15實驗試劑1）LB培養基：10g/L胰蛋白胨5g/L酵母提取物10g/LNaCl用5NNaOH調pH至7.0，121℃高壓滅菌20min。16用無菌H2O配置100mg/ml，-20℃保存；在LB中的終濃度為100g/ml。2）Amp貯存液：174）STE：10mmol/L

Tris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA（pH8.0）0.1mol/L

NaCl3）TE：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA185）溶液I：50mmol/L

葡萄糖25mmol/L

Tris-HCl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）121℃高壓滅菌20min，4℃保存。196）溶液II：0.2mol/L

NaOH1%SDS注意：配0.2mol/L

NaOH時，臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋。207）溶液III：5mol/LNaAc60ml冰HAc11.5mlH2O28.5mlpH為4.8，4℃保存。218）25:24:1酚:氯仿:異戊醇9）氯仿10）無水乙醇11）70%乙醇2210）RNase：10mmol/L

Tris-HCl（pH7.5）15mmol/L

NaCl10mg/mlRNase11）質粒貯存液：含20g/mlRNase的TE或H2O231）葡萄糖

增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力的作用而降解（震蕩）。各種試劑的作用：242）EDTAMg2+、Ca2+螯合劑，抑制DNase活性，防止DNA被降解。253）NaOH-SDS

NaOH是強堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。

SDS是離子型表面活性劑，溶解細胞膜蛋白和細胞內蛋白，并結合成“蛋白質-SDS”復合物，使蛋白質（包括DNase）變性沉淀。4）NaAc-HAc緩沖液

用來中和NaOH變性液，使DNA復性。

高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。5）乙醇DNA分子以水合狀態“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環境。

一般使用2倍體積的無水乙醇。286）RNaseA

降解殘留的RNA，以免提取后的DNA中含有小分子RNA。297）TE緩沖液：DNA保存液，由Tris-HCl和EDTA配制。

EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），利于以后操作。

但苯酚會殘留在DNA溶液中（現已少用，多用各種商品化的層析柱純化DNA)。8）酚-氯仿-異戊醇

蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白質，使蛋白質沉淀。實驗步驟3）將細菌沉淀重懸于0.5mlSTE中，12000rpm離心1min，棄上清。1）將菌落接種于2ml含100g/ml的LB中，37℃振搖過夜。2）取1.5ml培養物于1.5mlEppendorf管中，于4℃離心12000rpm1min，棄上清。4）將細菌沉淀重懸于100l4℃預冷的溶液I中，蓋緊管口，vortex劇烈振蕩，使細菌沉淀完全分散，放置5-15min。5）加200l溶液II，蓋緊管口，快速顛倒Eppendorf管5次，使管整個內表面均與溶液II接觸（不要振蕩），冰上放置5-10min。6）加入150l4℃預冷的溶液III，蓋緊管口，溫和振蕩10sec，冰上放置5min。7）4℃離心15000rpm5min，將上清轉移至另一EP管中。8）加入等量酚-氯仿-異戊醇，振蕩混勻，于4℃離心15000rpm2min，將上清轉移至另一EP管中。9）加入等量氯仿，振蕩混勻，于4℃離心15000rpm2min，將上清轉移至另一EP管中。10）加入2倍體積無水乙醇，振蕩混勻，室溫放置5min（或-70℃放置30min），4℃離心15000rpm10min，小心吸去上清，將附于管壁的液滴除盡。11）用4℃預冷的70%乙醇洗滌DNA沉淀1-2遍，按上述方法除盡上清，37℃干燥5-10min。12）用含RNase的TE或H2O溶解DNA，貯存于-20℃。

許多公司都研制出成套的商品化質粒提取試劑盒，原理大都依照堿裂解法，但在純化步驟上采用柱層析，實驗步驟參考相應的Protocol。37微量加樣器的使用方法3、將吸頭浸入待移取的液體液面下2-3mm處，慢慢松開按鈕，液體在大氣壓的作用下進入吸頭內。待吸入要求量的液體后，將加樣槍撤離液面，擦去吸頭外側的液體，注意不能接觸吸頭尖部。1、將加樣槍刻度或讀數調至所需定量吸取的液體量值，并裝上合適的吸頭。2、將按鈕壓至第一停點位置（有明顯的阻滯感）并保持，以擠出吸頭內空氣，形成吸頭內負壓。385、繼續按住按鈕，撤出加樣槍，將吸頭棄于特定的盛污染吸頭的器皿中，松開按鈕至起始位置，將加樣槍豎直懸掛在加樣槍架上。4、將加樣槍移至待加入液體的容器，讓吸頭位于容器液面的近上方。輕輕壓下按鈕至第一停點位置，讓液體緩緩流出。待液體將流盡時，繼續將按鈕下壓至第二停點位置，并讓吸頭尖部輕輕接觸液面上方的容器壁，以免產生氣泡。402、要保證在整個吸液過程中，吸頭尖端要一直處于液面之下，即防止吸空造成吸樣不準確。1、加樣前，一定要檢查吸頭是否上緊，以免液體漏出或取液不準。3、吸取液體完成后排出液體之前，一定要擦去吸頭四周的液體，特別是在取液量較少時尤其要注意這一點，但要防止接觸吸頭尖端。注意事項：415、排出液體時，在液體將排盡時，要輕輕讓吸頭尖端接觸容器壁，以免在加樣的容器中形成氣泡。4、吸取液體和排出液體動作都一定要慢，因為動作過快時，液體因表面張力吸附在吸頭壁上，造成移液不準。所取液體的粘度越高，越應該注意這個問題。426、加樣完成后，應在棄去使用過的吸頭后，方才松開按鈕至起始位置，以免吸頭內的殘留液體回吸到槍頭，造成交叉污染。7、注意使用一次性吸頭，避免交叉污染。8、如不使用，要把加樣槍的量程調至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態以保護彈簧。。43一、實驗目的及要求二、實驗設備及要求三、實驗內容與步驟四、實驗結果與數據處理五、分析與討論實驗報告的內容44提質粒步驟1.室溫10000xg1min離心收集菌體2.加入250ulSolutionI/RNaseA充分重懸菌體3.加入250ulSolutionⅡ并輕柔顛倒混勻多次直到液體清亮。2min室溫孵育。4.加入350ulSolutionⅢ并顛倒離心管多次使充分混勻，直到有白色絮狀沉淀產生。5.室溫，≥13000xg，15min離心6.小心吸取上清到HiBind柱中（每次700ul），室溫，10000xg，1min離心，直到所有上清都過了柱7.加入