猴鼻腔組織病理學檢查方法學探討

猴鼻腔組織病理學檢查方法學探討

近年來的研究表明，一些抗高血壓、鎮痛劑、抗生素和抗高血壓藥物通過鼻粘膜吸收，比口服更有效。很難從鼻腔吸收的多肽和蛋白質類藥物,當選用合適的黏膜促透劑或制成生物降解性微球等新劑型給藥時,能提高鼻腔吸收的生物利用度［1］。石蠟制片是毒性病理學中常用的技術,在國內外藥物非臨床安全性評價的病理學研究中仍是主要的技術手段［2］,石蠟制片質量直接影響病理學家對藥物毒性的評價,國內對于非人靈長類鼻腔的一致性病理制片方法還沒有相關報道。本文以食蟹猴為例,從鼻腔的解剖、固定、脫鈣液的選擇、4個切面的取材等方面對猴鼻腔制片的多個環節進行探討,以期快速地獲得符合毒性病理學鏡檢要求的一致性猴鼻腔HE染色切片,并對各切面的不同鼻粘膜上皮類型進行了簡要描述。1材料和試劑1.1實驗動物食蟹猴,2~3歲,普通級,體重2~3kg,購自海南新正源生物科技有限公司[合格證號:SCXK(瓊)2011-0002]。1.2主要試劑蘇木精、醇溶伊紅購自武藤化學公司,58℃-60℃高溫石蠟購自徠卡公司,二甲苯、乙醇、氯仿、甲酸、甲醛等購自北京化學試劑公司。1.3主要儀器Tissue-TekVIP6全封閉組織脫水機,TCEMJ-2型自動包埋機,IVS-410滑動式切片機,石蠟切片伸展器,PS-125WH型水浴鍋,石蠟熔融爐(SAKURA公司),電鋸(史塞克公司)。2猴鼻發育小鼠鼻牙的制備工藝2.1解剖和固定食蟹猴靜脈注射3.5%的戊巴比妥鈉進行麻醉(麻醉劑量為35mg·kg－1),待麻醉后,從股動脈放血至可視粘膜蒼白。然后剝開猴頭部皮膚,使頸部彎曲,切斷頭后部肌肉,從枕大孔處剪斷頸關節和脊髓。簡單剔除左右咬肌后,使用電鋸沿額骨、顳骨、枕骨鋸開［3］。摘出大腦和垂體后,用電鋸將眉弓和下頜骨鋸掉,盡量剔除多余的肌肉,將摘取的鼻腔用10mL注射器從兩側鼻孔緩慢注入3mL左右10%中性緩沖福爾馬林液,以排出鼻腔內存留空氣以免影響鼻腔內組織的及時固定,然后及時將鼻腔放入10%中性緩沖福爾馬林液中固定5~7d。2.2脫鈣把固定好的鼻腔用氯仿、酒精等量混合液浸泡6~10h。然后使用無水乙醇作用30min,更換新的無水乙醇作用30min,作用完倒掉無水乙醇水洗20min以上,移至脫鈣液。脫鈣液為JYBL-Ⅲ50%甲酸脫鈣液［4］。脫鈣液的配制方法:甲酸50mL,甲醛10mL,蒸餾水40mL。將配好的脫鈣液放入適當大小的容器(根據組織體積判斷)內,將水洗充分的鼻腔組織塊浸入脫鈣液中,組織和脫鈣液的比例一般為1∶15~20。通常食蟹猴鼻腔的脫鈣需要4~6d。2.3取材將脫鈣完全的鼻腔組織從脫鈣液中取出,直接流水沖洗至少8h,將水洗后鼻腔組織移至取材臺進行取材。以牙齒為標志物通過鼻腔橫截面(垂直于硬腭)進行切取,采用國際通用的針對鼻腔吸入毒性試驗的取材方法,需要垂直于硬腭取4個面。第1個切面在第1前磨牙前(圖1-A、2-A、3-A);第2個切面在第1、第2前磨牙之間(圖1-B、2-B、3-B);第3個切面在第1磨牙后包括鼻腔旁邊的上頜竇(圖1-C、2-C、3-C);第4個切面在鼻咽部軟腭的前端和后端中間的位置(圖1-D、2-D、3-D)［5－6］。2.4脫水取材結束后進行脫水。猴鼻腔脫水程序如下:70%乙醇1.5h2次,80%乙醇1.5h2次,95%乙醇1h2次,100%乙醇0.5h2次,二甲苯0.5h2次,石蠟1h3次(石蠟溫度均為58~60℃)。2.5切片、染色脫水結束后石蠟包埋,滑動切片機切片厚度約3~5μm,展片水溫度42~44℃,烤片溫度44℃,HE染色。3不同部位可顯示組織的結構以上所描述的猴鼻腔解剖、固定、脫鈣、取材、脫水、包埋和切片方法,是國家藥物安全評價監測中心臨檢與病理室經過長期實踐和探索而建立起來的。按上述方法制成的猴鼻腔HE染色切片,表面平整,組織結構清晰、完整,染色對比鮮明,可清晰顯示猴鼻腔不同部位包括粘膜上皮和粘膜下組織在內的多種結構(圖4),例如第1個切面可顯示鱗狀上皮、移行上皮及呼吸上皮,以鱗狀上皮為主,圖4-A所示鱗狀上皮較厚,固有層內皮脂腺等結構清晰可辨;第2個切面亦可顯示鱗狀上皮、移行上皮及呼吸上皮,圖4-B所示移行上皮介于鱗狀上皮和假復層纖毛柱狀上皮之間,與鱗狀上皮分界明顯,與呼吸上皮分界不明顯,猴的移行上皮較厚,4-5層細胞厚度;第3個切面可顯示呼吸上皮和嗅上皮,第4個切面可顯示呼吸上皮,圖4-C~-E所示不同部位呼吸上皮為典型的假復層纖毛柱狀上皮;圖4-F所示為嗅上皮,由嗅覺感覺神經元、支持細胞和基底細胞組成,嗅上皮還有少量的微絨毛細胞和鮑曼氏腺。4主要操作要點非人靈長類猴鼻腔的毒性病理檢查一致性切片方法在國內還沒有相關報道,由于猴鼻腔組織成分復雜,包括皮膚、肌肉、腺體、脂肪、結締組織和骨組織,進行脫鈣時需要面對酸類對其他組織的破壞作用,因此猴鼻腔對脫鈣的要求很高,不僅要將骨脫好鈣,還要盡可能降低對其他組織的破壞。脫鈣液的選擇以及脫鈣后組織的除酸,直接關系到病理切片的質量。對于猴鼻腔脫鈣來說,甲酸是較為理想的脫鈣液,它的優點在于脫鈣迅速、效果較佳,更重要的是它對鼻粘膜組織的損害比較小,對染色影響不大。甲酸在低濃度時是很好的脫鈣液,一般濃度不超過20%,當濃度達到50%時,其脫鈣的效果是最理想的。但要注意,濃度的加大確實加快了脫鈣的速度,但對組織的影響也有所加大,當然比其他無機酸的破壞作用還是較低的。猴鼻腔組織脫鈣后的充分除酸是保證染色不受影響的前提,目前常用的除酸方法包括:(1)使用堿處理;(2)使用70%乙醇處理;(3)流水沖洗。經過長時間實踐作者認為在把握好沖洗時間的前提下,流水沖洗簡單易行是較好的除酸方法。另外,更換固定液、脫脂液和脫鈣液的時候要注意,使用鑷子輕輕晃動猴鼻腔見有氣泡從鼻孔處出來后停止,或者使用10mL注射器伸入固定液、脫脂液和脫鈣液中把猴鼻腔中的空氣抽出,以免影響鼻腔內部的脫脂和脫鈣。除上述因素外,石蠟的選擇,切片展片的水溫、染色偏色的控制等因素對制片亦有很重要的影響［7］。通過上述方法制成的猴鼻腔切片,除了可以觀察鼻粘膜上皮和皮下組織外,其他一些結構也可以通過這4個切面進行組織病理學評價。比如,鼻淚管、壺腹竇、咬肌及三叉神經等。由于鼻腔給藥具有許多其它途徑無法比擬的優越性,通過選擇合適的藥物劑型,可使鼻粘膜在較長時間內保持高藥物濃度,可加速藥物透過鼻黏膜吸收,提高藥物的生物利用度。一些目前只能通過注射或口服途徑給予的藥物,如胰島素、蛋白質、核酸、多糖等,將出現鼻腔給藥新劑型,以減輕副作用,提高療效,方便使用,更好地為人類健康服務。本文介紹的非人靈長類鼻腔一致性切片制片方法,可以顯示出鼻腔不同種類的上皮及其周圍組織,為這類新型鼻腔給藥藥物的毒性病理學評價奠定了基礎。隨著對鼻腔生理結構及治療疾病機理的深入研究,人們發現通過鼻腔給藥不但可以治療局部鼻腔疾病,還可以用于一些突發狀況和救急,例如急痛和心臟病突發等,鼻腔給藥還可以用于一些慢性病,如糖尿病、生長功能障礙等［8］。在標準化體系下全面的鼻腔檢查對于吸入途徑及其他途徑給藥而言也具有非常重要的意義。目前,吸入途徑給藥實驗引起呼吸道病變的報道很多,但是非吸入途徑給藥實驗呼吸道組織的病變,尤其是上呼吸道的病變經常會遺漏。通過常規詳細檢查上呼吸道,尤其是鼻腔,上呼吸道病變的檢出率比預期高很多。通常,腫瘤性病變常常位于鼻腔的前部及中部,而非腫瘤性病變發生于嗅上皮。鼻非腫瘤性病變包括:呼吸上皮增生,嗅上皮變性、壞死和萎縮,嗅上皮化生為呼吸上皮,以及新生成的呼吸上皮的增生。鼻腫瘤包括:腺瘤、腺癌、鱗狀細胞癌和神經母細胞瘤等［9］。呼吸上皮增生常見鼻中隔、鼻甲和腹側篩竇鼻甲［10］。鱗狀細胞癌,更常出現在鱗狀上皮化生的呼吸、移行或嗅上皮區域［11］。血管內皮瘤雖然