水質(zhì) 7種青霉素的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1水質(zhì)7種青霉素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件描述了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水中7種青霉素的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、樣品制備、實(shí)驗(yàn)步驟、結(jié)果計(jì)算、精密度、檢出限和定量限。本文件適用于地表水和廢水中青霉素G（PenicillinG）、甲氧西林（Meticillin）、阿洛西林（Azlocillin）、哌拉西林（Piperacillin）、青霉素V（PenicillinV）、氯唑西林（Cloxacillin）和雙氯西林（Dicloxacillin）7種青霉素的測定，其他青霉素類化合物經(jīng)適用性驗(yàn)證可參照執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ/T92水污染物排放總量監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理樣品經(jīng)過濾后直接進(jìn)樣或經(jīng)固相萃取柱富集和凈化后進(jìn)樣，用液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜（LC-MS/MS）儀進(jìn)行檢測。根據(jù)保留時(shí)間和特征離子峰定性，外標(biāo)法定量。5干擾和消除5.1當(dāng)樣品中存在基質(zhì)干擾時(shí)，可通過優(yōu)化色譜條件、稀釋樣品、減少進(jìn)樣體積以及對樣品進(jìn)行預(yù)處理等方式降低或消除，采用固相萃取法時(shí)，還可以通過減少取樣體積或增加試樣的稀釋倍數(shù)降低基質(zhì)干擾。5.2當(dāng)樣品中存在同分異構(gòu)體干擾測定時(shí)，可通過改變色譜條件提高分離度或選擇不同的二級質(zhì)譜子離子消除干擾。6試劑和材料6.1除另有說明外，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的要求。6.2乙腈（CH3CN）：色譜純。6.3甲醇（CH3OH）：色譜純。6.4甲酸（HCOOH）：ρ（HCOOH）=1.22g/mL。6.5硫酸（H2SO4ρ（H2SO4）=1.84g/mL。6.6氫氧化鈉（NaOH）。26.7乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)。6.8氫氧化鈉溶液：ρ（NaOH）=0.4g/mL。稱取40g氫氧化鈉（6.6）溶于水中，定容至100mL。6.9甲酸溶液：1+2000。取1mL甲酸（6.4）加入2000mL水中。6.10甲酸/甲醇混合溶液：1+1000。取1mL甲酸（6.4）加入1000mL甲醇（6.3）中。6.11青霉素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：ρ=100μg/mL。可用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制，組分包括青霉素G、甲氧西林、阿洛西林、哌拉西林、青霉素V、氯唑西林和雙氯西林，貯備液在-18℃以下避光保存，可保存5d。也可直接購買有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照制造商的產(chǎn)品說明進(jìn)行保存。使用時(shí)應(yīng)恢復(fù)至室溫，并搖勻。6.12青霉素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)使用液：ρ=1.0μg/mL（參考濃度）。將青霉素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（6.11）按需要用甲醇（6.3）稀釋。標(biāo)準(zhǔn)使用液現(xiàn)配現(xiàn)用。6.13濾膜：0.22μm，水相。6.14濾膜：0.22μm，有機(jī)相。6.15氮?dú)猓杭兌取?9.99％。7儀器和設(shè)備7.1液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：三重四級桿質(zhì)譜，配有電噴霧離子源（ESI），具備多反應(yīng)監(jiān)測功能。7.2色譜柱：填料為3.5μmODS，柱長10cm，內(nèi)徑2.1mm的反相色譜柱或其他等效C18反相液相色譜柱。7.3固相萃取裝置：自動或手動，流速可調(diào)節(jié)。7.4固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物或等效萃取柱，規(guī)格為6mL/200mg。7.5濃縮裝置：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置或氮吹濃縮儀等性能相當(dāng)?shù)脑O(shè)備。7.6pH計(jì)：精度為0.01個(gè)pH單位，具有溫度補(bǔ)償功能。7.7微量注射器或移液槍：10μL、50μL、100μL、250μL、1000μL。7.8采樣瓶：250mL或500mL具磨口塞的棕色玻璃瓶。8樣品制備8.1樣品采集8.1.1按照HJ/T91和HJ/T92的相關(guān)規(guī)定采集樣品。8.1.2用預(yù)先洗滌干凈并干燥的磨口棕色玻璃瓶（7.8）采集水樣。采樣前不應(yīng)用水樣預(yù)洗采樣瓶，采樣瓶應(yīng)完全注滿不留氣泡。8.2樣品保存水樣4℃以下冷藏、避光保存，3d內(nèi)完成分析或萃取。8.3試樣制備8.3.1直接進(jìn)樣法取適量水樣經(jīng)濾膜（6.13）過濾，置于進(jìn)樣瓶中，等待進(jìn)樣。8.3.2固相萃取法分別用10mL甲醇（6.3）和10mL水活化固相萃取柱（7.4），在活化過程中應(yīng)確保小柱中填料表面不露出液面。量取200mL水樣，加入0.5gEDTA（6.7），使用硫酸（6.5）或氫氧化鈉溶液（6.8）調(diào)節(jié)水樣的pH值至3.0±0.1，水樣以約5mL/min的流速通過固相萃取柱。再用10mL水淋洗小柱，去除雜質(zhì)。之后用氮?dú)猓?.15）吹干小柱。用3mL甲酸/甲醇混合溶液（6.10）洗脫富集后的小柱，再用3mL甲酸/甲醇混合溶液（6.10）浸泡小柱5min，用6mL甲酸/甲醇混合溶液（6.10）以1mL/min的速度洗脫樣品，收集全部洗脫液。用濃縮裝置（7.5）將上述洗脫液濃縮至1.0mL以下，用甲醇（6.3）定容至1.0mL，混勻后過濾膜（6.14），置于進(jìn)樣瓶中，待測。38.4空白試樣的制備8.4.1實(shí)驗(yàn)室空白8.4.1.1以水代替樣品，按照水樣處理（8.3.1）相同操作步驟，制備直接進(jìn)樣法空白試樣。8.4.1.2以水代替樣品，按照水樣處理（8.3.2）相同操作步驟，制備固相萃取法空白試樣。8.4.2全程序空白采樣前按照樣品采集（8.1）和樣品保存（8.2）方法，用水代替樣品，在采樣現(xiàn)場制備全程序空白樣品。9實(shí)驗(yàn)步驟9.1儀器條件9.1.1液相色譜條件：——流動相：流動相A甲酸溶液（6.9），流動相B乙腈（6.2），梯度洗脫程序見表1；——流速：0.5mL/min；——柱溫：25℃;——進(jìn)樣體積：5.0μL。表1液相色譜流動相梯度洗脫程序%%09.1.2質(zhì)譜條件：——電噴霧離子源（ESI），正離子模式；——毛細(xì)管電壓：4.0kV；——干燥氣溫度：350℃;——干燥氣流速：11L/min；——霧化氣氣壓：1.72×105Pa（25psi）；——多離子反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM），條件見表2。4表2目標(biāo)化合物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件sV8注：帶*的為定量離子。9.2校準(zhǔn)9.2.1初始校準(zhǔn)在初次使用儀器，或在儀器維修、更換色譜柱或連續(xù)校準(zhǔn)不合格時(shí)需要進(jìn)行初始校準(zhǔn)。即建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)≥0.995，否則重新繪制校準(zhǔn)曲線。9.2.2連續(xù)校準(zhǔn)每20個(gè)樣品或每批次（少于20個(gè)樣品/批）應(yīng)測定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，其測定結(jié)果與該點(diǎn)濃度的相對誤差應(yīng)在±20％之內(nèi)。9.3校準(zhǔn)曲線的繪制9.3.1取一定量青霉素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)使用液（6.12），制備至少5個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)系列，青霉素類抗生素的質(zhì)量濃度分別為2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L、80.0μg/L和100μg/L，貯存在棕色進(jìn)樣小瓶中，校準(zhǔn)曲線需臨用現(xiàn)配。9.3.2在儀器最佳工作條件下，對標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣，以目標(biāo)組分的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。9.4樣品測定取待測試樣（8.3），按照與繪制校準(zhǔn)曲線相同的儀器分析條件進(jìn)行測定。9.5空白試驗(yàn)按與試樣測定相同的條件（9.1）進(jìn)行空白試樣（8.4）的測定。10結(jié)果計(jì)算與表示10.1目標(biāo)化合物的定性在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間偏差在±2.5％之內(nèi)；每種化合物的質(zhì)譜定性離子至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子，且樣品中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的定性離子的相對豐度進(jìn)行比較，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。5表3定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差±20%±25%±30%±50%10.2目標(biāo)化合物的定量分析按條件分析，得到目標(biāo)化合物的MRM色譜圖，參見附錄A。目標(biāo)化合物經(jīng)定性鑒別后，根據(jù)定量離子的峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算。按式（1）計(jì)算樣品中青霉素類化合物的質(zhì)量濃度：式中：ρi——樣品中組分i的質(zhì)量濃度，單位為納克每升(ng/L)；ρxi——從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得組分i的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/L）；V1——萃取液濃縮定容后的體積，單位為毫升（mL）；V——水樣體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）。10.3結(jié)果表示當(dāng)直接進(jìn)樣法的測定結(jié)果大于10.0μg/L時(shí)，數(shù)據(jù)保留三位有效數(shù)字，當(dāng)結(jié)果小于10.0μg/L，保留至小數(shù)點(diǎn)后一位。當(dāng)固相萃取法的測定結(jié)果大于10.0ng/L時(shí)，數(shù)據(jù)保留三位有效數(shù)字，當(dāng)結(jié)果小于10.0ng/L，保留至小數(shù)點(diǎn)后一位。11精密度在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作者使用相同設(shè)備，按相同的測試方法，并在短時(shí)