CN118416083B 一種利用大腸桿菌胞外多糖抗生物膜的方法 （中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所）

號(hào)US2009318382A1,2009.12.24一種利用大腸桿菌胞外多糖抗生物膜的方法本發(fā)明公開一種利用大腸桿菌胞外多糖抗糖抑制細(xì)菌生物膜的形成以減少生物膜形成總糖由以下摩爾百分?jǐn)?shù)的單糖組成：甘露糖21.大腸桿菌胞外多糖在制備抑制細(xì)菌生物膜的形成及分散細(xì)菌成熟生物膜的藥物中3劑的殺滅以及免疫系統(tǒng)的識(shí)別。[0003]在自然界及臨床上，微生物生物膜以多種細(xì)菌共同存在的共生生物膜形式為使用會(huì)造成微生物產(chǎn)生耐藥性，因此提高微生物對(duì)抗生素的敏感性是目前亟需解決的問4[0020]進(jìn)一步，所述抑制細(xì)菌生物膜的形成是將含大腸桿菌胞外多糖的PBS與細(xì)菌菌懸[0021]所述分散細(xì)菌成熟生物膜是根據(jù)孔板或基底大小將100μL_2mL細(xì)菌菌懸液培養(yǎng)[0023]進(jìn)一步，所述抑制細(xì)菌生物膜的形成是將含大腸桿菌胞外多糖和抗生素的PBS與[0024]所述分散細(xì)菌成熟生物膜是根據(jù)孔板或基底大小將100μL_2mL細(xì)菌菌懸液培養(yǎng)將細(xì)菌菌懸液培養(yǎng)24_48h后，棄去培養(yǎng)菌液，然后加入含大腸桿菌胞外多糖的PBS孵育2_[0027]進(jìn)一步，所述含大腸桿菌胞外多糖和抗生素的PBS中大腸桿菌胞外多糖的濃度為[0029]當(dāng)分散細(xì)菌成熟生物膜時(shí)，所述含大腸桿菌胞外多糖和抗生素的PBS中抗生素的[0031]本發(fā)明使用無殺菌能力但對(duì)生物膜有顯著抑制效果的大腸桿菌胞外多糖來抑制[0032]大腸桿菌胞外多糖可以通過阻止細(xì)菌間以及細(xì)菌與表面的黏附從而抑制細(xì)菌生5[0033]對(duì)于妥布霉素這類抗生素而言，在低濃度下會(huì)出現(xiàn)促進(jìn)[0039]圖6為本發(fā)明實(shí)施例12中大腸桿菌胞外多糖的提前孵育對(duì)妥布霉素殺滅成熟生物膜內(nèi)的細(xì)菌的作用。[0040]圖7為本發(fā)明實(shí)施例13中大腸桿菌胞外多糖的提前孵育對(duì)妥布霉素穿透成熟生物[0043]為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說[0046]含大腸桿菌胞外多糖的PBS是指將凍干后的大腸桿菌胞外多糖溶解在10mM的PBS地，金黃色葡萄球菌菌懸液是將金黃色葡萄球菌(ATCC6538)在TSB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18_銅綠假單胞菌在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18_24小時(shí)，調(diào)節(jié)其菌懸液的濃度為107CFU/mL桿菌菌懸液是將大腸桿菌(ATCC25922)在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18_24小時(shí)，調(diào)節(jié)其菌懸液6[0050]挑取大腸桿菌(ATCC25922)菌落置于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，在37℃搖床培養(yǎng)18_24h。磨后的大腸桿菌胞外多糖/KBr置于壓片模具中進(jìn)行壓片，制備好的KBr壓片放置于紅外光的弱峰分別是羥基和C_H伸展振動(dòng)產(chǎn)生的1642cm[0056]將含有大腸桿菌胞外多糖的PBS與銅綠假單胞菌(PAO1)菌懸液進(jìn)行混合(體積比[0058]將含有大腸桿菌胞外多糖的PBS與金黃色葡萄球菌菌懸液進(jìn)行混合(體積比為1:7[0065]將銅綠假單胞菌(PAO1)菌懸液在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h和48h，棄去培養(yǎng)菌10mM的PBS清洗浮游細(xì)菌，加入2.5％的戊二醛溶液對(duì)生物膜進(jìn)行固定，在4℃下固定4h以[0067]將金黃色葡萄球菌菌懸液在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，棄去培養(yǎng)菌液，將濃度100μg/mL的含有大腸桿菌胞外多糖的PBS加入到上述培養(yǎng)好的成熟生物膜中進(jìn)行孵育，孵的含有大腸桿菌胞外多糖的PBS加入到上述培養(yǎng)好的成熟生物膜中進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間8與銅綠假單胞菌(PAO1)菌懸液在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，分別記為陰性對(duì)照組(濃度與銅綠假單胞菌(PAO1)菌懸液在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，分別記為陰性對(duì)照組(濃度別加入PBS、妥布霉素、大腸桿菌胞外多糖以及大腸桿菌胞外多糖稀釋的妥布霉素進(jìn)行孵9將生物膜內(nèi)的細(xì)菌分散為菌懸液，對(duì)得到的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，將細(xì)菌濃度稀釋至使用激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜內(nèi)細(xì)菌的死活情況。結(jié)果參見圖7，與同濃度抗生素相[0086]本實(shí)施例使用小鼠植入物生物膜感染模型驗(yàn)證大腸桿菌胞外多糖用于治療生物[0087]使用康道寧Sylgard184PDMS制備植入物，在植入物置于用LB肉湯對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，可知胞外多糖的使用顯著減少了PDMS表面生物膜內(nèi)的菌落數(shù)(圖9中a)。以及H&E染色，可知大腸桿菌胞外多糖的使用顯著改善了生物膜感染對(duì)小鼠的皮膚感染帶明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。