熒光定量PCR和FISH技術診斷肺結核的價值比較

熒光定量PCR和FISH技術診斷肺結核的價值比較摘要】目的比較熒光定量PCR和FISH技術對肺結核診斷的敏感性和特異性。方法共收集300例明確診斷為肺結核的患者作為陽性對照組，以及收集300例健康志愿者（明確排除肺結核患者）做為陰性對照組。收集800例新收臨床疑似肺結核患者做為研究組。收集該800例患者的肺活檢標本以及同期的痰液標本，其中痰液進行涂片、結核桿菌分離培養以及結核桿菌DNA熒光定量PCR檢測和FISH檢測。比較熒光定量PCR和FISH技術對肺結核診斷陽性符合率和陰性符合率。結果

①FISH技術檢測結核桿菌陽性符合率為99.3%；熒光定量PCR檢測結核桿菌陽性符合率為97.3%。兩者陽性符合率存在統計學差別（p=0.015）。②FISH技術檢測結核桿菌陰性符合率為98.2%，熒光定量PCR技術檢測結核桿菌陰性符合率為96.9%。兩者陰性符合率存在統計學差別（p=0.007）。結論與熒光定量PCR比較，FISH對肺結核診斷具有較高的陽性符合率和陰性符合率。

【關鍵詞】肺結核熒光定量PCR熒光標記原位雜交技術

doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2024.11.031

結核病被列為我國重大傳染病之一，是嚴重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病［1-2］。根據世界衛生組織的統計，我國是全球22個結核病流行嚴重的國家之一，同時也是全球27個耐多藥結核病流行嚴重的國家之一［3］。近十余年來，隨著分子生物學的高速發展，以及檢測手段的提高、檢測軟件的不斷發展，基因診斷技術作為結核病非培養診斷技術是近年來結核病診斷的一項重大突破，具有特異、敏感、快速鑒定結核病的優點。常規PCR技術、熒光定量PCR、巢式PCR等技術在結核病診斷中應用的報道屢見不鮮。但PCR技術也存在不少的局限性，如由于該技術操作復雜，往往易造成細胞前處理受損，擴增過程的非特異性，使得檢測信號微弱，不易辨識，造成假陽性、假陰性結果等［4-5］。熒光標記原位雜交技術（FISH）是一種非放射性原位雜交技術，該技術的出現彌補了熒光定量PCR的不足之處，使之具有更深刻的應用價值［6-7］。因此，本研究擬初步探討和比較熒光定量PCR技術和FISH技術對肺結核病診斷的敏感性和特異性，現報告如下。

1研究方法

1.1研究對象

患者收集時間為2024年1月~2024年1月，共收集300例明確診斷為肺結核的患者做為陽性對照組，以及收集300例健康志愿者（明確排除肺結核患者）做為陰性對照組。收集800例新收臨床疑似肺結核患者做為研究組。收集該800例患者的肺活檢標本以及同期的痰液標本，其中痰液進行涂片、結核桿菌分離培養以及結核桿菌DNA熒光定量PCR檢測，肺活檢標本經過固定、脫水、包埋制成蠟塊，進行切片抗酸染色及結核桿菌FISH檢測。

1.2研究方法

①探針的制備優化：根據NCBI報道的人源結核桿菌基因序列，選取結核桿菌Ag85A基因（GenBank編號：NC-000962）及IS6110基因（GenBank編號：NC-002944）作為靶序列，結合運用primer5.0、oligo6.0和Primerexpress2.0軟件，設計出兩組結核桿菌特異性探針引物（引物序列具體見表1），將兩組引物及其擴展產物放入NCBI作BLAST進行同源性分析，結果顯示與其它基因序列異源，從而避免了雜交時非特異性的存在。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。②FISH檢測流程的優化：操作方法參照《FluorescenceinSituHybridizationTechnology》(BarbaraBeatty等，美國)，針對FISH技術關鍵步驟進行反應條件的摸索優化。③所有800例試驗組人群同時還進行痰液涂片檢查、痰液結核桿菌分離培養、痰液結核桿菌DNA熒光定量PCR檢測。

1.3熒光定量PCR檢測

使用達安基因股份有限公司的結核桿菌（TB）核酸擴增PCR熒光檢測試劑盒（Cat.#DA-052），對痰液標本進行結核桿菌核酸檢測，主要采用胰酶消化法對痰液標本進行消化處理，處理完成后提取結核桿菌基因組DNA，用熒光定量PCR進行結核桿菌DNA的擴增檢測，操作步驟按照試劑盒的說明進行。

1.4統計分析

將痰液涂片檢查、痰液結核桿菌分離培養、痰液結核桿菌DNA熒光定量PCR檢測、肺組織病理標本抗酸染色、結核桿菌FISH檢測結果均為陽性者定義為陽性，結果均為陰性者定義為陰性，其他情況均定義為可疑。①陽性符合率：依據上述定義，結核桿菌FISH檢測的陽性符合率=結核桿菌FISH檢測陽性數/所有標本檢測陽性數。②陰性符合率依據上述定義，結核桿菌FISH檢測的陰性符合率=結核桿菌FISH檢測陰性數/所有標本檢測陰性數。采用spss17.0統計軟件進行數據統計分析，定量資料采用均數±標準差表示，定性資料采用百分率表示，組間比較采用t-檢驗或卡方檢驗，p2結果

2.1FISH技術和熒光定量PCR檢測結核桿菌陽性符合率

300例明確診斷為肺結核患者，298例患者FISH檢測為陽性。另外800例臨床可疑為肺結核患者中，依據痰液涂片檢查、痰液結核桿菌分離培養檢測診斷為肺結核患者共有378例，其中375例FISH結果為陽性，因此，FISH技術檢測結核桿菌陽性符合率為99.3%［（298+375）/（300+378）］。300例明確診斷為肺結核患者，290例患者熒光定量PCR檢測為陽性。另外800例臨床可疑為肺結核患者中，依據痰液涂片檢查、痰液結核桿菌分離培養檢測診斷為肺結核患者共有378例，其中370例熒光定量PCR結果為陽性，因此，熒光定量PCR檢測結核桿菌陽性符合率為97.3%［（290+370）/（300+378）］。卡方檢驗比較FISH技術和熒光定量PCR檢測技術得陽性符合率存在統計學差別（X2=3.678，p=0.015）。

2.2FISH技術和熒光定量PCR檢測結核桿菌陰性符合率

300例明確排除肺結核患者中，有5例FISH檢測為陽性。另外800例臨床可疑為肺結核患者中，依據痰液涂片檢查、痰液結核桿菌分離培養、痰液結核桿菌DNA熒光定量PCR檢測排除為肺結核患者共有422例，其中8例FISH結果為陽性，因此，FISH技術檢測結核桿菌陰性符合率為98.2%［（295+414）/（300+422）］。300例明確排除肺結核患者中，有9例熒光定量PCR檢測為陽性。另外800例臨床可疑為肺結核患者中，依據痰液涂片檢查、痰液結核桿菌分離培養檢測排除為肺結核患者共有422例，其中13例熒光定量PCR結果為陽性，因此，熒光定量PCR技術檢測結核桿菌陰性符合率為96.9%［（291+409）/（300+422）］。卡方檢驗比較FISH技術和熒光定量PCR檢測技術得陰性符合率存在統計學差別（X2=5.065，p=0.007）。

3討論

衛生部全國第五次結核病流行病學抽樣調查結果顯示，目前我國結核病年發病人數約為130萬，占全球發病的14.3%，位居全球第2位。2024~2024年，全國共發現和治療肺結核患者828萬例，其中傳染性肺結核患者450萬例［8－9］。結核病是一種慢性傳染病，其發病規律和流行特點決定了在今后相當長的時期內其危害將持續存在。傳統上診斷肺結核，有三種途徑：①痰液及病變組織中查出結核桿菌；②結核的病理組織常規檢查；③胸部X線檢查，但該方法不能確診肺結核，因為肺部其他疾病，如肺炎、肺寄生蟲病、肺部腫瘤等病變也可出現類似肺結核病變的肺部X線影像學表現，單憑X線檢查，許多患者會誤診誤治，不但給患者造成經濟上的損失，還會導致病情惡化。

熒光定量PCR技術和FISH技術是近年來新開展的用于檢測肺結核的新技術，但兩種技術對肺結核診斷的陽性符合率和陰性符合率是否存在差別目前未見文獻報道。本研究結果表明，與傳統檢測方法相比，熒光定量PCR技術和FISH技術均具有較高的陽性符合率和陰性符合率［10-11］。以此同時，與熒光定量PCR技術相比較，FISH技術的陽性符合率和陰性符合率更高，差別具有統計學意義。我們認為這可能與如下因素有關［12-15］：（1）熒光定量PCR檢測結核桿菌作為快速診斷技術已普遍應用于臨床，具有高特異性和敏感性，由于該技術操作復雜，往往易造成細胞前處理受損，擴增過程的非特異性，使得檢測信號微弱，不易辨識，造成假陽性、假陰性結果；（2）FISH技術是一種非放射性原位雜交技術，具有以下優點：①熒光試劑和探針經濟、安全；②探針穩定，一次標記后可在兩年內使用；③實驗周期短，能迅速得到結果，特異性好，定位準確；④FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；⑤多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；⑥針對染色體的檢查既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。

綜上所述，本研究結果表明，與傳統檢測方法以及熒光定量PCR比較，FISH對肺結核診斷具有較高的陽性符合率和陰性符合率，值得臨床推廣。

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