CHAP1-酶工程基礎.ppt

1、第一章 酶工程基礎,第一節 酶和酶工程概述 第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制 第三節 酶的催化特點和影響因素 第四節 酶活力的測定 第五節 酶動力學和抑制作用,第一章 酶工程基礎,第一節 酶和酶工程概述,一、酶及酶工程研究的意義 二、酶學研究簡史 三、酶工程,第一節 酶和酶工程概述,第一節 酶和酶工程概述,（一）酶的概念 酶是由細胞產生的具有催化功能的蛋白質（或核酸），亦稱生物催化劑。,一、酶及酶工程研究的意義,第一節 酶和酶工程概述,如：苯丙酮尿癥(PKU) 患兒的苯丙氨酸羥化酶先天缺失，不能將苯丙氨酸轉化為酪氨酸，苯丙氨酸在血液中累積，使大腦發育受到影響； 同時由于酪氨酸來

2、源減少，致使黑色素合成不足，出現皮膚“白化病”。,酶催化的生物化學反應，稱為酶促反應（ Enzymatic reaction ） 在酶的催化下發生化學變化的物質，稱為底物（ substrate ）,第一節 酶和酶工程概述,（二）酶在生命體內的重要性,1、催化生物代謝過程中的各種生化反應，以維持正常的生命活動。 2、核酸合成、復制要靠酶；出了差錯，要靠修復酶進行糾正。 3、蛋白質合成，一旦錯誤氨基酸摻入，就要有專門的酶去識別、切除、再合成。,第一節 酶和酶工程概述,1、以酶為工具的研究 2、以酶為研究對象,（三）酶的研究,第一節 酶和酶工程概述,（1）用酶來治療疾病 天冬酰胺酶治療白血病 多酶片

3、(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)助消化 鏈激酶、尿激酶、納豆激酶等清除血凝塊,1、以酶為工具的研究,（2）基因工程用酶：內切酶、連接酶、TaqDNA聚合酶、逆轉錄酶等。,L-門冬酰胺 L-門冬氨酸+NH3,天冬酰胺酶治療白血病,天冬酰胺酶能將血清中的門冬酰胺水解，而門冬酰胺是細胞合成蛋白質及增殖生長所必需的氨基酸； 正常細胞有自身合成門冬酰胺的功能，而急性白血病等腫瘤細胞則無此功能，因而當外來天冬酰胺酶使門冬酰胺急劇缺失時，腫瘤細胞因既不能從血中取得足夠門冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白質合成受阻，增殖受抑制，細胞大量死亡。,L-天冬酰胺 L-天冬氨酸+NH3,天冬酰胺酶治療白血病,注入該酶后，人

4、體正常cell由于有L-天冬酰胺合成酶，自己能夠合成L-天冬酰胺，因此細胞蛋白質合成不受影響。而癌cell本身缺乏或沒有L-天冬酰胺酶，自己不能合成L-天冬酰胺，外源的L-天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解掉，因此細胞蛋白質的合成受到影響，引起癌cell的死亡。,第一節 酶和酶工程概述,（1）測定肝癌 A、開始：甲胎蛋白（AFP） B、 現在：“巖藻糖苷酶”（AFU） （2）神經細胞內的酶,2、以酶為研究對象,第一節 酶和酶工程概述,甲胎蛋白（AFP）是人胚胎期血清中的主要蛋白成分，其合成部位主要是在人類胚胎的肝臟。,人類胚胎在宮內發育16周后AFP迅速下降，當胎兒出生后AFP的濃度維持在較低水平

5、； 研究表面：原發性肝癌患者血清中的AFP相當于正常人的數十倍乃至數萬倍。,第一節 酶和酶工程概述,“巖藻糖苷酶”（AFU）屬溶酶體酸性水解酶類，參與含巖藻糖苷的糖蛋白、糖脂的降解、代謝。,研究表明：腫瘤組織中的巖藻糖轉換率增加，AFU活性增高。,第一節 酶和酶工程概述,2005年3月，中科院上海科學研究院的袁小兵博士等，在自然雜志上發表原創工作，首次發現神經細胞內有二種酶：CDC42酶和RhoA酶。 功能：對神經纖維的生長導向作出精細的調節，對疼痛和止痛起調節作用。,神經細胞內的酶,第一節 酶和酶工程概述,二、酶學研究簡史,公元前800年 烹調方法中已使用來自微生物的酶 1833-1835年

6、 淀粉的第一次酶解 1836年 發現消化酶-胃蛋白酶 1839-1897年 60年關于酵母的爭論 1876年 酶-源于希臘語，意為在酵母中 1883年 食物中蛋白質的測定 1894年 加酶食品的第一次商業化生產 1894-1913年 科學家建立“鑰匙-鎖理論” 1908-1913年 在皮革軟化過程中酶取代糞便 1914年 第一次生產出濃縮洗衣皂 1926年 科學家發現酶是蛋白質,第一節 酶和酶工程概述,1941-1943年 生產胰島素和胰蛋白酶的新方法 1953-1958年 Watson 和 Crick發現DNA是雙螺旋結構 1963年 堿性蛋白酶-洗滌劑用酶的突破 1967年 微生物篩選 1

7、965-1974年 淀粉工業的重大突破 1984-1986年 第一個由基因修飾的微生物生產的酶 1992年 建立用于酶工業生產的克隆表達 1995年 三維結構模型 1996年 生物多樣性網絡 1997年 利用分子篩選技術發現新的微生物 1998年 基因混組 1999年 生態克隆表達 2000年 Fusarium venenatum作為新的工程用菌,第一節 酶和酶工程概述,三、酶工程,（一）酶工程的概念 是將酶、細胞或細胞器等置于特定的生物反應裝置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段將相應原料轉化成有用物質并應用于社會生活的一門科學技術。 是酶學、微生物學的基本原理與化學工程有機結合而產

8、生的交叉科學技術，是生物工程的主要內容之一。,第一節 酶和酶工程概述,（二）酶工程的研究內容,酶的生產 酶的改造 酶的應用,天然酶在開發應用方免受到限制,第一節 酶和酶工程概述,（三）酶工程的分類,根據研究和解決問題的手段不同分為： （1）化學酶工程：指天然酶、化學修飾酶、固定化酶及化學人工酶的研究和應用。 （2）生物酶工程：是酶學和以基因重組技術為主的現代分子生物學技術相結合的產物。主要包括3個方面,第一節 酶和酶工程概述,（2）生物酶工程,克隆酶用基因工程技術大量生產酶（ -淀 粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶） 突變酶對酶基因進行修飾，產生遺傳修飾酶 合成新酶設計新酶基因，合成自然界不曾

9、有過的酶,第一節 酶和酶工程概述,（四）酶工程的研究方向,1、酶的固定化 2、酶如何不被體內酶識別、降解問題 3、酶活性檢測如何更簡便、特異、快 速、靈敏的方法學問題 4、酶的抑制劑與激活劑 5、基因工程表達的酶制劑等,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,一、酶的分類 二、酶的命名 三、酶的組成和結構特點 四、酶的作用機制,一、酶的分類,1961年國際酶學委員會提出將酶分為6類： 1.氧化還原酶：RH+R(O2)=R+RH( H2O) 催化電子的轉移 2.轉移酶：RG + R=R + RG 催化功能基團的轉移 3.水解酶：RR + H2O=RH + ROH 催化水解反應 4.裂合

10、酶：RR=R + R 催化非水解性、非氧化性分解 5.異構酶：R=R 催化分子內基團的轉移 6.連接酶（合成酶）：R+R+ATP=RR+ADP 利用共價鍵將分子連接到一起,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,核酶是唯一的非蛋白酶，它是一類特殊的RNA或DNA，能夠催化RNA或DNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應。,7. 核酶（催化核酸）ribozyme,脫氫酶：催化直接從底物上脫氫的的反應，需要輔酶I(NAD+)或輔酶(NADP+)作為氫供體或氫受體起傳遞氫的作用） 氧化酶：催化底物脫氫，并氧化生成H2O2或H2O等。 例如：乳酸脫氫酶催化乳酸的脫氫反應。,1. 氧化-還原酶

11、Oxidoreductase,催化基團轉移反應：即將一個底物分子的基團或原子轉移到另一個底物的分子上。 例如：谷丙轉氨酶催化的氨基轉移反應。,2. 轉移酶 Transferase,催化：底物的加水分解反應。 主要包括：淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如：脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應,3. 水解酶 hydrolase,催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反應及其逆反應。 例如:延胡索酸水合酶催化的反應,4. 裂合酶 Lyase,催化各種同分異構體的相互轉化，即底物分子內基團或原子的重排過程。 例如:6-磷酸葡萄糖異構酶催化的反應。,5. 異構酶 Isomerase,又稱為

12、合成酶，能夠催化兩個物質形成一個新物質的反應,這類反應必須與ATP分解反應相互偶聯。 例如:丙酮酸羧化酶催化的反應 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,6. 連接酶 Ligase or Synthetase,二、酶的命名,（一）習慣命名 （二）系統命名 （三）酶的編號,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,（一）習慣命名 根據 作用底物（S）：淀粉酶 蛋白酶 反應性質 ：脫氫酶 轉氨酶 兩者結合 ：乳酸脫氫酶 谷丙轉氨酶 來源 ：胃蛋白酶 木瓜蛋白酶 性質 ：堿性磷酸酯酶 （二）系統命名 命名原則 底物1：底物2 + 反應類型 + 酶 “L-乳酸： NAD + 氧化還原 + 酶”,乳酸脫

13、氫酶（習慣命名）,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,（三）酶的編號,酶的編號用四個數字表示一個酶： Enzyme Commision EC 1. 1. 1. 1 醇脫氫酶 類 亞類 亞亞類 編號 第1大類; 以CHOH為供體; 以NAD+,NADP+為受體; 1,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,三、酶的組成和結構特點,（一）酶的組成形式 1.單體酶( monomeric enzyme) ：由一條或多條肽鏈組成，肽鏈間以共價鍵結合的酶。 2.寡聚酶(oligomeric enzyme) ：由若干相同或不相同的亞基以非共價鍵結合而組成，亞基一般沒有活性，必須相互結

14、合后才有活性。 3.多酶復合體(multienzyme system) ：由2個或2個以上功能相關的酶通過非共價鍵連接而成的、能進行連續反應的體系就是多酶復合體。,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,（二）酶的結構特點,(holoenzyme) （apoenzyme） (cofactor) 全 酶 = 酶蛋白 + 輔因子 （金屬離子、輔酶、輔基）,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,（金屬離子） （輔酶、輔基）,有活性 無活性 無活性,1、金屬離子 （1）分類（據結合程度不同） 金屬酶：酶蛋白與金屬離子結合緊密，主要是一些過渡金屬離子。 金屬激酶：金屬離子與酶的結合

15、一般較松散，在溶液中，酶與這類離子結合而被激活。主要是一些堿金屬離子或堿土金屬離子。 （2）作用 活性中心的組成成分：如多酚氧化酶中的銅 在E與S之間起作用：如羧肽酶中的鋅 穩定結構,2、輔酶、輔基,（1）根據與酶蛋白的結合程度可分為 輔酶(coenzyme) ：指與酶蛋白結合比較松弛的小分子有機物質，通過透析方法可以除去。例如硫胺素、焦磷酸。 輔基(prosthetic group) ：是以共價鍵和酶蛋白結合，結合的較緊密，不能通過透析法除去，需要經過一定的化學處理才能與酶蛋白分開。例如FAD：黃素腺嘌呤二核苷酸，FMN：黃素單核苷酸。,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,維生

16、素的特點: 1、種類多 2、需要量少 3、常常需要從食物中獲得 4、大部分充當輔酶,（2）輔酶、輔基往往是由維生素參與形成的小分子有機物,脂溶性維生素： A D E K 維生素 硫辛酸（氧化型） 水溶性維生素： Vc VB: B1 B2 B3（泛酸） B5(PP) B12（氰鈷胺素） B6 （吡哆醇/醛/胺） B7 (生物素 ） B11（葉酸） 硫辛酸（還原型）,維生素B1 硫胺（素）,硫胺素（B1）,功 能：以輔酶方式參加糖的分解代謝。TPP是脫羧 酶、脫氫酶的輔酶。 缺乏癥：腳氣病、中樞神經和腸胃患糖代謝失常。,焦磷酸硫胺素（TPP）,維生素B2核黃素,功能：作為遞氫輔酶，參與生物氧化作用

17、 每人每天需要量：兒童0.6mg，成人1.6mg。動物體內不能合成維生素B2。 缺乏癥： 口角炎、舌炎、唇炎、眼瞼炎，角膜血管增生等癥狀。,維生素B3泛酸、遍多酸,功能：以CoA形式參加代謝，是酰基的載體，是體內?；傅妮o酶，對糖、脂、蛋白質代謝過程中的乙酰基轉移有重要作用。,需要量：成人每天為510mg，一般膳食的泛酸含量豐富。 未發現典型的缺乏癥。,維生素B5維生素PP,包括尼克酸（煙酸）和尼克酰胺，尼克酰胺為維生素B5的化學名。,尼克酸,尼克酰胺,功能：以NAD+或NADP+形式作為脫氫酶的輔酶而起到遞氫體的作用。,+2H,-2H,缺乏癥：膳食中長期缺乏維生素PP會引起對稱性皮炎，又叫賴

18、皮病。,維生素B6 吡哆素,包括：吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺。,吡哆醇,吡哆醛,吡哆胺,（磷酸吡哆醛，PLP）,功能：作為輔酶參加多種代謝反應，包括脫羧、轉氨、氨基酸內消旋、Trp代謝、含硫氨基酸的脫硫、羥基氨基酸的代謝和氨基酸的脫水等。,缺乏癥：導致皮膚、中樞神經系統和造血機構的損害，可以引發皮炎。,維生素C 抗壞血酸,功能： 促進各種支持組織及細胞間粘合物的形成，是脯氨酸羥化酶的輔酶。 對生物氧化有重要作用。 缺乏癥：壞血病，毛細血管易出血，齒、骨發育不全或退化。,四、酶的作用機制,（一）酶的結構組成及活性中心 （二）酶作用專一性機理 （三）酶作用高效性機理 （四）影響酶高效性的因素,第二節

19、酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,（一）酶的結構組成及活性中心,結合部位 活性中心 必需基團 催化部位 酶的結構 活性中心以外的必需基團 其它部分,1、酶的活性中心(active center) ：是指結合底物和將底物轉化為產物的區域，通常是相隔很遠的氨基酸殘基形成的三維實體。,活性中心,2、結合部位：酶分子中與底物結合，使底物與酶的一定構象形成復合物的基團。 酶的結合基團決定酶反應的專一性。,3、催化部位：酶分子中催化底物發生化學反應并將其轉變為產物的基團。 催化基團決定酶所催化反應的性質，同時也是決定反應的高效性。,4、調控基團：酶分子中一些可與其他分子發生某種程度的結合并引起酶分

20、子空間構象的變化，對酶起激活或抑制作用的基團。,酶的活性中心示意圖,一些酶活性中心的基團,（二）酶作用專一性機理,1.鎖鑰模型 2.誘導契合模型,酶作用的專一性,專一性：一種酶只能作用于一種或一類底物。表現為： （1）絕對專一性：一種底物，一個反應。 如尿酶尿素 （2）相對專一性：大多數酶為相對專一 性，允許底物分子上有小變動。,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,1、鎖鑰模型（1890）：,認為整個酶分子的天然構象是具有剛性結構的，酶活性部位的形狀與所需作用的底物形狀相吻合，它們可以象鑰匙與鎖一樣互相匹配。 此學說可以較好的解釋酶的立體異構專一性；但不能解釋酶的多底物現象、酶對

21、正反方向的催化等。,鎖鑰模型,2、誘導契合模型（1964年 ）： 該學說認為酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互補的，而是在酶和底物結合的過程中，由于酶與底物相互誘導，使底物分子或酶分子，有時是兩者的構象同時發生了一定的變化后才互補的，這個動態的辨認過程稱為誘導契合。,誘導契合模型,動畫,酶與底物靠近,定向,酶與底物相互誘導變形,契合形成中間產物,產物脫離,A. 靠近定向,靠近 電性吸引疏水作用,定向,酶,底物,誘導契合機制,B. 誘導契合,活性中心催化基團進行催化,誘導 互補性結構變化,能否契合 專一性的由來,契合,C. 產物脫離,酶復原催化劑,非酶促反應 S P 酶促反應 S+E ES P

22、+E,底物酶中間物,過渡態,產物酶中間物,酶作用的實質：在于降低反應活化能！,（三）酶作用高效性機理中間產物學說（過渡態學說）,區別：反應分兩步走，活化能大大降低，因此反應容易進行。,（四）影響酶高效性的因素,1. 鄰近定向效應 2. 變形或張力 3. 廣義的酸堿催化 4. 共價催化（親核催化/親電催化） 5. 酶的活性中心為疏水區域,1、鄰近效應、 定向效應,鄰近效應：在酶促反應中，由于酶和底物分子之間的親和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趨勢，最終結合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效濃度大大增加的效應。 定向效應：當專一性底物向酶活性中心靠近時，會誘導酶分子構象發生改變，使酶活性

23、中心的相關基團和底物的反應基團正確定向排列，同時使反應基團之間的分子軌道以正確方向嚴格定位，使酶促反應易于進行。 以上兩種效應使酶具有高效率和專一性特點。,鄰近定向效應,普通化學反應隨機碰撞（受濃度、碰撞角度影響） 相當于社會上的自由戀愛 酶的活性中心相當于“婚姻介紹所” 鄰近作用提高了酶活性（“婚介”）中心的底物濃度（非婚男女集中） 定向作用縮短了底物與催化基團間（“男女”）的距離 提高反應速度（成功率）108倍,2. 變形或張力,當酶與底物靠近時，不僅酶構象受底物作用而變化，底物分子也常常受酶作用而變化，也就是酶使底物分子中的敏感鍵發生“變形”或產生張力 ，從而促使底物中的敏感鍵更易于破裂

24、。因而更容易形成一個互相契合的酶底物的復合物而提高催化效率。,底物分子發生形變,同時形變,產物,3、廣義的酸堿催化,廣義的酸堿催化：是通過瞬時的向反應物提供質子（H+）或從反應物接受質子以穩定過渡態，加速反應的一類催化機制。,酶分子中可以作為廣義酸、堿的基團,廣義酸基團 （質子供體） 廣義堿基團（質子受體）,酸的催化： H+與反應物結合，其結合物更有反應性，因而反應速度大為加快。 堿的催化：從反應物上移去H+，反應速度也大為加快。 許多反應中既受酸的催化，也受堿的催化。,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,4、共價催化,（1）共價催化：酶通過與底物形成反應活性很高的共價過渡產物，

25、使反應活化能降低，從而提高反應速度的過程。 （2）它包括兩種類型：親核催化和親電催化 親核基團： His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等； 親電子基團：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+ 某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用。,催 化 機 理,第二節 酶的分類、命名、組成、結構特點和作用機制,親電催化：親電基團具有強烈親合電子的原子中心，它的催化機理與親核試劑正好相反。,親核催化：親核基團具有強烈供給電子的原子中心。它能發揮催化作用是由于能供給底物一對電子，因此可與底物共價結合。,5、酶的活性中心為疏水區域,酶活性中心處于一個非極性環境

26、中，其介電常數比在水介質（極性介質）中的介電常數低，在非極性環境中兩個帶電基團之間的靜電作用比在極性環境中顯著增高，從而有利于同底物的結合。,綜上所述，酶催化作用機理： 酶與底物結合時，由于酶的變形（誘導契合）或底物變形使二者相互適合，并依靠離子鍵、氫鍵、范德華力的作用和水的影響，結合成中間產物，在酶分子的非極性區域內，由于酶與底物的鄰近、定向，使二者可以通過親核親電催化、一般酸堿催化等催化方式進行多元催化，從而大大降低反應所需的活化能，使酶促反應迅速進行。,第三節 酶的催化特點和影響因素,一、酶的催化特點,（一）高催化效率 （二）強專一性 （三）可調節性 （四）活性的不穩定性,第三節 酶的催

27、化特點和影響因素,（一）高催化效率,在37或更低的溫度下，酶的催化速率是沒有催化劑催化的化學反應速率的10121020倍 ； 比一般催化劑催化的反應速率高1071013倍 。,第三節 酶的催化特點和影響因素,第三節 酶的催化特點和影響因素,以固氮酶為例（NH3的合成）： 植物中：25和中性pH下由固氮酶完成。 工業上：由氮和氫合成氨需要在10-90MPa條件下，還要有鐵及其它微量金屬氧化物作催化劑才能完全反應。,第三節 酶的催化特點和影響因素,專一性,（二）強專一性,修整作用專一性,第三節 酶的催化特點和影響因素,（1）鍵專一：只要求合適的化學鍵，對鍵兩端的基團并無嚴格要求。,（2）基團專一：

28、不但要求一定的化學鍵，還要求鍵一端的基團是一定的。 a-葡萄糖苷酶 a-糖苷鍵 糖苷鍵的一端是葡萄糖 底物：蔗糖、麥芽糖,（1）旋光異構專一性：,（2）順反異構專一性：,例如： DNA聚合酶 I：校正、切除錯配核苷酸 氨酰-tRNA合成酶：校正、切除錯配AA,修整作用專一性：酶存在校讀功能，能對錯誤參入的核苷酸、氨基酸進行修正。,第三節 酶的催化特點和影響因素,（三）可調節性,酶活性的調節控制主要有7種方式： 1.酶濃度的調節 2.激素調節 3.共價修飾調節：在一種酶分子上，共價地引入一個基團從而改變它的活性。 4.限制性蛋白水解作用與酶活力調控 5.激活劑、抑制劑的調節 6.反饋調節 7.金

29、屬離子和其他小分子化合物的調節,第三節 酶的催化特點和影響因素,2.激素調節乳糖合成酶,催化亞基,修飾亞基,+,乳糖合成酶,第三節 酶的催化特點和影響因素,4.限制性蛋白水解作用與酶活力調控,酶原酶在生物體內首先合成出來的無活性前體。 酶原的激活酶原必須在一定的條件下去掉一個或幾個特殊的肽鍵，從而使酶的構象發生一定的變化，才有活性，這一過程稱為酶原激活。,本質：酶的活性中心形成或暴露的過程 意義：避免自身受損傷,6.反饋調節,反饋抑制：催化此物質生成的第一步反應的酶，往往可以被它的終端產物所抑制，這種對自我合成的抑制就叫反饋抑制。例如：,第三節 酶的催化特點和影響因素,二、影響酶活力的因素,（

30、一）底物濃度 （二）產物濃度 （三）酶濃度 （四）溫度 （五）pH （六）抑制劑 （七）激活劑,一、底物濃度S,在低底物濃度時：反應速度與底物濃度成正比，表現為一級反應特征。,隨著底物濃度的增高：反應速度不再成正比例加速；反應為混合級反應。,當底物濃度達到一定值：反應速度達到最大值（V max），此時再增加底物濃度，反應速度不再增加，表現為零級反應。,二、產物濃度,正反饋調節：反應的中間產物或終產物能夠起激活變構劑的作用，使酶促反應速率加快。 負反饋調節：反應的中間產物或終產物對酶起變構抑制作用，使酶促反應速率降低。,三、酶濃度,在一定條件下酶促反應的速度與酶的濃度成正比。 當底物濃度達到飽和

31、時，增加酶的濃度可增加反應速度，酶促反應的速度與酶的濃度成正比關系。,四、溫度,溫度對酶促反應速度的影響： a. 溫度升高,增加底物分子的熱能，酶促反應速度加快，一般溫度每升高10，反應速度約增加1倍； b. 溫度升高超過一定范圍,會引起酶三維結構發生變化或變性，導致酶活性降低甚至喪失，反應速度很快下降。,最適溫度（optimum temperature）：使酶促反應速度達最大時的溫度。,五、pH,a、影響酶分子構象的穩定性 b、影響酶分子（包括輔因子）必需基團的解離狀態，影響酶與底物的結合； c、影響底物分子的解離狀態。,最適pH（optimum pH）：酶反應速度最大 時的溶液pH。,pH

32、值影響酶活力的原因：,六、抑制劑,抑制作用：通過與酶分子上的某些必需基團結合，使這些基團的結構和性質發生改變，從而引起酶活力下降或喪失，這種作用稱為抑制作用。 變性作用：變性劑,七、激活劑(activator）,（1）無機離子：金屬離子（K+ Na+ Mg2+ Zn2+ Fe2+ Ca2+）、陰離子（Cl- Br-）、氫離子 （2）小分子有機化合物：某些還原劑、乙二胺四乙酸（EDTA） （3）生物大分子（主要是激活酶原） 無活性的酶原 有活性的酶,磷酸化酶b,磷酸化酶b激酶,金屬離子的激活作用,許多金屬離子是酶的輔助因子，是酶的組成成分，參與催化反應中的電子傳遞。 有些金屬離子可與酶分子肽鏈上

33、側鏈基團結合，穩定酶分子的活性構象。 有的金屬離子通過生成螯合物，在酶與底物結合中起橋梁作用。,酶活力：也稱酶活性，指酶催化一定化學反應的能力。其大小可用在一定條件下，它所催化的某一化學反應的反應速率來表示，兩者呈線性關系。所以測定酶的活力就是測定酶的反應速率。 酶反應速率：用單位時間內、單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。單位：濃度/單位時間,一、酶活力與酶反應速率,第四節 酶的活力測定,產物濃度,酶反應速率曲線,時間,1、底物濃度的降低； 2、酶的部分失活； 3、產物對酶的抑制； 4、產物增加引起的逆反應速度的增加。,斜率=濃度/時間=,引起酶反應速率降低的主要原因：,酶的活力單位

34、：,1、“國際單位”（IU）： 1961年提出，1個酶活力單位是指在該酶的最適條件(最適底物濃度和最適pH）下， 25C、1分鐘內能催化1微摩爾底物所需的酶量，或催化1微摩爾產物形成所需的酶量。1 IU = 1 mol/min 2、Kat：1972年提出，最適條件下， 25C、每秒鐘能催化1摩爾底物轉化為產物所需的酶量。1 Kat = 1 mol/s,1Kat = 6107 IU,二、酶的比活力 代表酶的純度，用每mg蛋白質所含的酶活力單位數表示，對同一酶來說，比活力愈大，表示酶的純度愈高。 酶的比活力=酶活力（單位）/ mg（蛋白） 單位：用IU/mg蛋白、 Kat/mg蛋白表示。 比活力大

35、小可用來比較每單位質量蛋白質的催化能力。,三、酶活力的測定方法,終止法：在恒溫系統中進行酶促反應，間隔一段時間后終止反應，然后測定反應物的消耗量或產物的生成量，從而計算出酶活性。終止反應的方法有加熱、強酸、強堿、三氯乙酸、SDS、乙醇等。 連續反應法：不需要取樣終止反應，而是基于反應過程光譜吸收、氣體體積、酸堿度、溫度等的變化，用儀器跟蹤監測反應，記錄結果，算出酶活力。,三、酶活力的測定方法,1.分光光度法：利用底物和產物在紫外或可見光部分的光吸收的不同，選擇一適當的波長，測定反應過程中反應進行的情況。 優點：簡便、節省時間和樣品，可檢測到nmol/L水平的變化。 2.熒光法：主要是根據底物或

36、產物的熒光性質的差別來進行測定。 3.酶聯測定法：許多酶促反應中，產物出現或底物的消失并不會引起光吸收的變化。在這種情況下要測定催化此反應的酶的活力，可將其與第二個具有特殊吸收光變化的酶反應相偶聯。,酶與底物的中間產物學說,一、米氏方程 (米曼氏公式),底物濃度與酶反應速度關系的數學表達式：,第五節 酶動力學和抑制作用,1、米氏常數Km ：當v=1/2 Vmax 時的底物濃度,Km=S,Km值：是當酶促反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度，它的單位是mol/L，與底物濃度的單位一樣。,米氏常數Km k2 + k3 k1,第五節 酶動力學和抑制作用,2、關于米氏常數Km的幾點說明,（1） K

37、m是ES復合物穩定性的量度 （2） 對許多酶而言，k2比k3大得多，這時的Km就變成了酶對底物的親和力的量度，因為它的值分別依賴于ES的生成或解離（即k1、k2的值）。,高Km值弱底物結合（k2k1） 低Km值強底物結合（k2k1）,2、關于米氏常數Km的幾點說明,（3）不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數，只與酶的性質有關，而與其濃度無關。 （4）Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定得到的，不同條件下具有不同的Km值。 （5）同一種酶有幾種底物就有幾個Km值，其中Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。,1、抑制作用與抑制劑 2、抑

38、制作用的類型和特點 3、一些重要的抑制劑 4、酶抑制劑的應用（P222）,二、酶的抑制作用,1、抑制作用與抑制劑 抑制作用：由于酶分子上的某些必需基團化學性質的改變，而引起酶活力下降或喪失，但并不使酶蛋白變性的現象稱為抑制作用。 （抑制作用不同于失活作用）,抑制劑（inhibitor） ：能夠引起抑制作用的物質，可以是正常細胞代謝物，也可以是外源物質。 （抑制劑不同于變性劑）,2、抑制作用的類型 （1）不可逆抑制作用 （2）可逆抑制作用 ,（1）不可逆抑制作用(irreversible inhibition) 定義：抑制劑與酶的活性中心的功能基團共價結合而抑制酶的活性,不能用透析或超濾等物理方

39、法除去抑制劑而恢復酶活性。 專一性不可逆抑制作用：這類抑制劑只作用于某種酶活性部位的必需基團或一類酶。 非專一性不可逆抑制作用：這類抑制劑作用于酶分子上一類或幾類不同的基團或作用于幾類不同的酶。 如：?；瘎┧狒突酋Ｂ鹊瓤墒姑傅鞍椎?OH、SH、NH2等發生?；姑甘Щ?。,不可逆抑制作用恢復酶活性的方法,例如： 有機磷殺蟲劑 乙酰膽堿脂酶（Ser-OH）,不可逆抑制,（2）可逆抑制作用(reversible inhibition) 定義：抑制劑與酶蛋白以非共價方式結合，引起酶活性暫時性喪失，抑制劑可以通過透析等物理方法被除去，并且能部分或全部恢復酶的活性。 根椐抑制劑與酶結合的情況，又可以分為三類：,區別,可逆竟爭性抑制（Competitiveinhibition）,某些抑制劑的化學結構與底物相似，因而能與底物竟爭與酶活性中心結合。當抑制劑與活性中心結合后，底物被排斥在反應中心之外，其結果是酶促反應被抑制了。,竟爭性抑制通?？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。,S,例1：丙二酸和戊二酸對琥珀酸脫氫酶結合但不能催化脫氫。,可逆競爭性抑制示意圖,I,例2：磺胺類藥物及其作用機理,磺胺類藥物可以抑制細菌的生長繁殖，治療細菌引起的各種疾病。 磺胺類藥物是對氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是對氨基苯甲酸的結構類似物，競爭性抑制二氫葉酸合成酶。,