實驗十七姊妹染色單體色差方法.ppt

實驗十七 姊妹染色單體色差方法,一、實驗目的,1.子解姐妹染色單體差別染色技術的原理和制作SCE標本的方法。 2.通過SCE標本的觀察，掌握SCE計數方法。,二、實驗原理,在DNA復制過程中，核苷的類似物5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxy uridine簡稱BrdUrd）或5-碘尿嘧啶核苷（5-Iodo-2-deoxy uridine簡稱IdUrd）可以代替核苷酸摻入新合成的DNA鏈，并占有胸腺嘧啶（Thymidine,T）的位置。哺乳類細胞在含有適當濃度的Brdurd的培養液中經歷二個分裂周期之后，其中期染色體的兩個單體的DNA雙鏈在化學組成上就有了差別：即一條染色單體的兩股DNA中的T位完全由BrdUrd代替，而另一條染色單體的兩股DNA中的一股含BrdUrd,另一股則不含BrdUrd，這樣的細胞經過制片和苯并咪唑熒光染料（Hoechst-33258）染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到兩條姐妹染色單體顯示強弱不同的熒光。兩股DNA鏈都含有BrdUrd的單體熒光較強，其中只有一股有BrdUrd的單體熒光較弱。 1974年Korenberg和Freedlender改進了這一方法，單獨用Giemsa染色即獲得姐妹染色單體差別染色（sister-chromatid differential staining簡稱SCD）（圖24-1）。這是因為雙股都含有BrdU核苷酸的DNA鏈組成的染色單體，螺旋化程度較低，在熱鹽溶液中受光的照射后更易于水解，從而影響了與Giemsa染料的親和力，因此染成較淺的顏色。這樣根據兩條姐妹染色單體所顯示的深淺不同的顏色，可以區別中期染色體的姐妹染色單體。,三、實驗材料,人的外周血。,四、實驗器具和藥品,1.用具：2mL和1mL滅菌注射器，吸管，移液管，離心管，量筒，燒杯，無菌青霉素瓶，試劑瓶，培養瓶，酒精燈，載玻片，天平，紫外燈（15W），離心機，恒溫培養箱，顯微鏡。 2.藥品配制：RPMI1640，肝素，植物凝血素（PHA），秋水仙素，青、鏈霉素，吉姆薩染液等。,五、實驗步驟,1.配制培養液,在無菌條件下，用20mL的青霉素瓶分裝5mL培養液，其中RPMI1640占80%，小牛血清占1520%；PHA0.2mL；青霉素100單位/mL；鏈霉素100微克/毫升。最后用3.5%NaHCO3調節pH至7.27.4。,2.加入BrdUrd,每5mL的培養液中加入BrdUrd 0.1mL，最終濃度為10ug/mL。,3.加入0.3mL靜脈血培養,每瓶培養液中加入0.3mL靜脈血，輕輕搖勻，用黑布避光，立即置37溫箱中培養。,4.加入秋水仙素繼續培養,培養72h左右，加入秋水仙素0.4-0.8ug/mL，繼續培養4h。,5.按常規收集細胞制片,用0.075mol/L KCl或蒸餾水低滲20min，用甲醇冰醋酸31配制的固定液固定兩次，每次15min，用氣干法制片，一天以后將染色體制片放入7080烤箱中烘烤12h，或放在37溫箱中存放備用。,6.染色體標本的差別染色方法處理,(1)堿的熱溶液處理 :將染色體標本浸在88的1mol/L NaH2PO4(pH為8.0)的溶液中，處理20min，取出后立即用蒸餾水沖洗，用常規Giemsa染色5min，再用蒸餾水沖洗，干燥，觀察。 (2)紫外燈照射誘發：染色體標本在37條件下擱置24小時后取出，放在4548的水浴鍋上，覆蓋一層2SCC溶液（0.3mol/L NaCl,0.03mol/L枸櫞酸鈉），15W紫外燈照射20-30min，燈管與載玻片之間距離為6厘米（照光期間防止2SCC溶液干涸）。照射完畢，用蒸餾水沖去2SCC，用3%Giemsa(pH6.8磷酸緩沖液稀釋)染色510min，水洗，氣干后鏡檢。,7. 鏡檢,在普通光學顯微鏡下觀察，可見姐妹染色單體呈現鮮明的深淺不同的顏色。,人體淋巴細胞姐妹染色單體互換,圖片,六、注意事項,1.培養基組成、培養液的酸堿度、培養溫度或培養時間等因素略加變動，可適用于其他一些哺乳動物、鳥類或兩棲類動物淋巴細胞的培養，用以觀察它們的姐妹染色單體色差。 2.BrdUrd溶液最好現配現用，一次使用不完，必須有黑布避光，4冰箱保存。 3.BrdUrd在培養開始時加入，或在培養后的24小時加入均可。 4